Секвенирование по Сэнгеру
1. Получение последовательности по хроматограмме
Анализировались файлы прямого (20_F.ab1) и обратного (20_R.ab1) прочтений. Полученная консенсусная последовательность: consensus.fasta
Длина начального нечитаемого участка для прямого прочтения около 18, дальше вполне различимо (Chromas считает 49), для обратного - 32 (Cromas считает 46). Прямое прочтение более-менее различимо до самого конца, но какие-то проблемы с "заплывами" начинают случаться за 44 нуклеотиды до конца (Cromas считает 33), для обратного прочтения длина нечитаемого участка около четырёх нуклеотидов (Cromas считает 13).
Соотношение сигнал/шум на протяжении обоих прочтений (не считая начала и конца) более-менее одинаково - порядка 10:1 - с небольшими отклонениями, однако есть пара особенных мест, наблюдающихся на обеих хроматограммах - вероятно, это ошибка при форезе, причём, судя по всему, форез обоих прочтений происходил рядом. Это очень высокий всплеск C со следующим за ним всплеском T на позициях 75-85 и меньшего размера всплески C и T на позициях 115-125.
Встреченные сложности при расшифровке приведены ниже (для обратного прочтения на изображениях ниже взята комплементарная цепь).
1: В обратном прочтении пик по какой-то причине оказался сопоставим по высоте с шумом. Разрешается при помощи второй цепи.
2: Для обратного прочтения произошла ошибка в ходе фореза и случился "залив краски". Но пики соответствующие нуклеотидам последовательности почти везде различимы, к тому же всё восстанавливается по второй цепи.
3: Программа по какой-то причине не распознала вполне различимые пики, которые, к тому же, подтверждаются другим прочтением.
4: Наблюдаются пики сходной высоты, которые могут быть как ошибкой (шумом), так и полиморфизмом. Проверить по второй цепи невозможно, поскольку там нечитемый начальный участок.
2. Нечитаемый участок
На рисунке представлен нечитаемый участок прямого прочтения. Можно видеть, что пики "размазаны" (нет чёткой послеодовательности узких пиков) и одновременно могут присутствовать пики нескольких цветов.
Причиной появления этого нечитаемого участка является, вероятно, неспецифический отжиг праймеров.