Нуклеотидный blast


1. Определение таксономии и функции прочтенной нуклеотидной последовательности
Чтобы определить таксономию, я запустила нуклеотидный бласт (BLASTN) с параметрами по умолчанию и поиском по базе данных Nucleotide collection (nr/nt) для исправленной последовательности прямой цепи из 6-го практикума (последовательность). На рисунке 1 представлен топ-20 находок. Видно (в том числе по выравниванию), что самые большые совпадения с родами Loxosomella и Loxosoma из семейства Loxosomatidae. Поэтому можно утверждать, что анализируемая последовательность принадлежит организму из того же семейства. Скорее всего, объект относится к роду Loxosomella, так как находки с максимальными параметрами Bit-score, query cover и ident относятся именно к нему.
Также можно заключить, что данная последовательность принадлежит гену, кодирующему 18S рРНК. Выравнивания с максимально близкими последовательностями представлены на рисунке 2. Ссылка на проект выравнивания в JalView.

Рис. 1 Находки при поисками с параметрами по умолчанию
Таблица №1
Таксономия
Домен Eukaryota
Царство Metazoa
Надтип Lophotrochozoa
Тип Entoprocta
Семейство Loxosomatidae
Род Loxosomella

Рис. 2 Выравнивание с максимально похожими последовательностями

2. Сравнение списков находок 3-мя разными алгоритмами BLAST
Чтобы сузить поиск, я органичила его типом Entoprocta (Внутрипорошицевые).
Blastn ищет любые гомологи.
Длина слова по умолчанию: 11 нуклеотидов.
Всего найдена 31 сходная последовательность (рис. 2). Две худшие находки имеют покрытие всего 3% и e-value 0.71, что больше значения, позволяющего считать последовательности гомологичными.
Discontiguous megablast ищет близкие гомологи.
Длина слова по умолчанию: 11 нуклеотидов.
Найно 29 последовательностей (рис. 3). Даже у худшей находки e-value достаточно маленький, чтобы говорить о некой гомологии. В общем, discontiguous megablast просто исключил из нахлдок blastn две последних, однозначно плохих находки.
Megablast ищет очень близкие гомологи.
Длина слова: 28 Матрица весов также отличается от предыдущих стратегий поиска. Match/Mismatch: 1/-2, штраф за гэп - линейный.
Находки те же самые, что и в discontiguous megablast, но с другими значениями bit-score, e-value, покрытия (рис. 4).

2. Описание ключей, используемых в таблицах особенностей
Ключи и аннатации к ним взяты с сайта INSDC.
Примеры - с сайта NCBI.


Рис. 2 Выдача blastn


Рис. 3 Выдача discontiguous megablast


Рис. 4 Выдача megablast

3. Гомологи трех белков в геноме одного организма
Для поиска гомологов были выбраны 3 белка: CISY_HUMAN, RPB1_HUMAN, PABP2_HUMAN.
Задание было выполнено с помощью пакета BLAST+. Командой
makeblastdb -in X5.fasta -dbtype nucl
была создана локальная база данных. Далее был запущен tblastn (ищет гомологов белка в транслированной нуклеотидной базе данных). Командой tblastn -db X5.fasta -query .fasta -outfmt 7
были получены таблица №3, 4, 5. А командой
tblastn -db X5.fasta -query .fasta >> out_.fasta
получены собственно выравнивания.
Первый белок CISY_HUMAN (ссылка в формате fasta, рис. 5) - цитратсинтетаза человека. Этот фермент катализирует реакцию конденсации ацетата (ацетил-CoA) и оксалооцетата с образование цитрата. Обнаружен почти во всех анаэробных организмах. Расположен в митохондриальном матриксе, но кодируется ядерным геномом и синтезируется рибосомами в цитоплазме, а затем переносится в митохондрии.
Всего tblastn нашел 6 предполагаемых гомологов (таблица №3, выравнивание), но рассматривать имеет смысл только два выравнивания (1 и 3) для scaffold-693 и scaffold-157. В этих выравниваниях, как видно из таблицы, сымые большие значения identity и bit-score и самые маленькие evalue. И судя по выравниванию последовательности, действительно, сходны. Такие данные позволяют говорить о наличии гомолога человеческой цитратсинтетазы у нашего организма (хотя возможно функция не сохранилась).


Рис. 5 Цитратсинтетаза
Таблица №3
Данные по выравниваниям
query id subject id % identity alignment length mismatches gap open q. start q. end s. start s. end evalue bit score
sp|075390|CISY_HUMAN scaffold-693 69,5 377 122 3 90 464 1243882 1245009 2e-180 565
sp|075390|CISY_HUMAN scaffold-693 48,44 64 33 0 26 89 1243623 1234814 7e-14 74,3
sp|075390|CISY_HUMAN scaffold-157 69,5 377 112 3 90 464 314582 315709 5e-180 564
sp|075390|CISY_HUMAN scaffold-158 46,88 64 34 0 26 89 314323 314514 1e-13 73,2
sp|075390|CISY_HUMAN scaffold-287 25,76 396 234 15 83 442 458091 546976 3e-22 100
sp|075390|CISY_HUMAN scaffold-212 28,08 260 159 10 206 452 460007 45273 1e-19 92,4

Второй белок TERT_HUMAN (ссылка в формате fasta) - человеческая теломера (рис. 6) - фермент, необходимый для репликации терминальной части хромосом. Активен в стволовых и раковых клетках, малоактивен или неактивен совсем в соматических. Две субъединицы теломеразы кодируются разными генами. Фермент состоит из теломеразной обратной транскриптазы, теломеразной РНК и дискерина. Основная функция теломеразного комплекса - удлинение теломерных участков хромосом за счет функционирования, как обратная транкриптаза. Фермент добавляет повторяющие короткое последовательности (5'-TTAGGG-3' у позвоночных, у других классов организмой последовательности другие) на 3'конец ДНК цепи, копируя свою РНК-компоненту.
Tblastn нашел 3 предполагаемых гомолога (таблица №4) и составил выравнивание. Последнее стоит совсем убрать из рассмотрения, судя по evalue. Два остальных тоже не настолько хорошие, чтобы утверждать гомологию. Выравнивание случайное (blast еще и гэпов понаставил кучу) и в данном геноме нет гомолога человеческой теломеразы.

Рис. 6 Теломераза
Таблица №4
Выравнивание с TERT_HUMAN
query id subject id % identity alignment length mismatches gap open q. start q. end s. start s. end evalue bit score
sp|O14746|TERT_HUMAN scaffold-17 26,58 568 374 17 452 1007 610942 612552 8E-23 105
sp|O14746|TERT_HUMAN unplaced-307 24,87 579 372 17 452 1007 14902 16518 5E-18 90,1
sp|O14746|TERT_HUMAN scaffold-361 29,63 81 54 2 409 487 82346 82107 42614 32

Третий белок RPB1_HUMAN (ссылка в формате fasta) - РНК-полимераза II. Фермент эукариотических клеток, который катализирует транскрипцию ДНК в РНК, используя в качестве субстрата рибонуклеозидтрифосфаты. Самый большой компонет РНК-полимеразы - наш белок (ДНК-зависимая субъединица RPB1 РНК-полимеразы II) - содержит в C-концевом домене 52 повтора YSPTSPS, что необходимо для полимеразной активности. RPB1 закрывает и открывает расселину в центре ядра полимеразы.
Найден 21 гомолог. Первая и третья находки (для scaffold-300 и scaffold-157) самые неплохие: evalue близко к нулю, а bit-score 1495 и 1390 соответственно. Identity около 50% может говорить о гомологии только отдельных доменов белка. И судя по выравниванию, где некоторые фрагменты очень сходны, а другие почти совсем не гомологичны, можно прийти к тому же выводу.


Рис. 6 РНК-полимераза
Таблица №5
Выравнивание с PABP2_HUMAN
query id subject id % identity alignment length mismatches gap open q. start q. end s. start s. end evalue bit score
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-300 51,65 1547 683 18 10 1520 173104 177657 0 1495
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-300 36,41 868 510 14 16 854 142461 139897 3E-146 509
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-300 29,48 424 230 10 1058 1474 138270 137185 2E-39 161
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-300 49,06 53 27 0 854 906 138639 138481 0,00000005 58,2
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-157 53,04 1397 616 16 137 1520 534515 530406 0 1390
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-157 36,75 868 507 14 16 854 562218 564782 2E-151 526
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-157 30,14 418 235 10 1058 1474 566409 567494 1E-38 159
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-157 52,25 111 51 1 11 121 534958 534632 1E-30 133
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-157 51,02 49 24 0 854 902 566040 566186 0,00000008 57,4
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-157 33,85 65 41 1 1011 1073 326645 326451 0,036 38,9
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-44 34,28 388 211 8 343 694 232854 233993 2E-50 197
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-44 45,28 159 85 2 764 920 234665 235141 2E-33 142
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-44 37,24 145 83 5 1056 1197 235352 235771 4E-17 88,2
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-44 31,18 170 109 4 1310 1478 236450 236938 8E-16 84
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-44 32,69 104 65 3 14 114 231513 231818 0,000000004 61,6
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-100 34,28 388 211 8 343 694 317738 318877 3E-49 194
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-100 45,28 159 85 2 764 920 319548 320024 3E-33 141
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-100 37,86 140 78 4 1056 1192 320235 320636 1E-16 86,7
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-100 31,18 170 109 4 1310 1478 321333 321821 4E-16 85,1
sp|P24928|RPB1_HUMAN scaffold-100 32,69 104 65 3 14 114 316391 316696 0,00000006 57,8
sp|P24928|RPB1_HUMAN unplaced-712 52,25 111 51 1 11 121 1 327 6E-35 132
статья.

4. Поиск гена белка, закодированного в одном скэффолде ''Amoboaphelidium''
Amoeboaphelidium protococarum - протист, родственный грибам, относится к Aphelida. Последовательность его генома находтся в файле X5.fasta.
Сначала была получена информация о длинах скэффолдов в файле X5.fasta с помощью команды
infoseq X5.fasta -only -name -length >> scaffolds.out
Для анализа я выбрала скэффолд 115 длины 160031. С помощью команды
seqret X5.fasta:scaffold-115 -out scaffold115.fasta
получила в файле scaffold115.fasta его последовательность.
С помощью megablast с ограничение поиска только по Fungi была найдена 21 сходная последовательность (рис. 10), причем большинство находок оказались генами, кодирующими пируват киназу - фермент, катализирующий финальную стадию гликолиза (рис. 9). Исходя из этого, а также вполне приемлимых значений cover, identity и e-value можно заключить, что именно этот ген закодирован в скэффолде 115.


Рис. 10 Результат поиска