РНК-полимераза прокариот состоит из нескольких субъединиц, среди которых важную роль играет сигма-фактор (σ-фактор), обеспечивающий специфическое связывание полимеразы с промотором. Для инициации транскрипции требуются специфические нуклеотидные консенсусные последовательности, которые сообщают σ-фактору, где именно связываться с ДНК. σ-фактор распознаёт последовательности в областях "-35" и "-10"; в области "-10" имеет консенсусную последовательность TATAAT, а область "-35" — TTGACA[1]. В данном практикуме мы рассмотрим сигнал TTGACA.
Рис. 1. Строение прокариотического промотора.
Сигнал представляет собой последовательность TTGACA, узнаваемую сигма-фактором σ70. После узнавания, фактор связывается с ДНК и собирается в комплекс с остальными субъединицами РНК-полимеразы (холофермент). Затем закрытый комплекс переходит в открытый комплекс, и при переходе к элонгации транскрипции, сигма-фактор диссоциирует от полимеразы[2]. Эффективность связывания σ-фактора с сигналом варьирует у разных видов, и, с учётом вариабельности сигнала, можно сделать вывод, что эффективность в целом низкая[1][3].
Задание 2
Построение PWM
Для работы я выбрал окрестность ATG кодона в геноме человека — последовательность Козак. При выполнении задания использовался скрипт, основанный на скрипте Георгия Муравьёва. После обработки таблицы генов человека я получил файлы с обучающей выборкой, тестовой выборкой и негативным контролем. Для обучающей выборки была построена позиционная весовая матрица (Таблица 1):
letter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
A
-0.27
-0.45
-0.16
-0.21
0.31
0.04
-0.32
1.22
-6.60
-6.60
-0.14
-0.01
-0.55
T
-0.35
-0.43
-0.44
-0.80
-1.52
-0.74
-1.18
-6.60
1.22
-6.60
-0.60
-0.50
-0.30
G
0.11
0.66
0.25
0.25
0.66
-0.07
0.25
-6.24
-6.24
1.58
0.77
-0.03
0.50
C
0.51
0.09
0.38
0.58
-0.41
0.57
0.75
-6.24
-6.24
-6.24
-0.39
0.48
0.29
По вышеприведённым данным были построены гистограммы распределений для разных выборок. Можно заметить, что распределение негативного контроля сильно смещено влево по отношению к распределениям тестового и обучающего наборов. В качестве порогового значения между положительным и отрицательным контролем выбрано значение веса 4. С учётом этого построена проверочная таблица (Таблица 2):
Судя по таблице, выбранное пороговое значение достаточно хорошо отражает разницу между положительным и отрицательным контролем.
Задание 3
Построение Logo
Для обучающей выборки была построена матрица информационного содержания (Таблица 3):
letter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
A
-0.09
-0.12
-0.06
-0.07
0.18
0.02
-0.10
1.76
0.00
0.00
-0.05
-0.00
-0.14
T
-0.10
-0.12
-0.12
-0.15
-0.14
-0.15
-0.15
0.00
1.76
0.00
-0.14
-0.13
-0.10
G
0.03
0.38
0.09
0.09
0.38
-0.02
0.10
0.00
0.00
2.29
0.50
-0.01
0.24
C
0.25
0.03
0.16
0.31
-0.08
0.30
0.46
0.00
0.00
0.00
-0.08
0.23
0.11
IC(j)
0.09
0.16
0.07
0.17
0.34
0.15
0.31
1.76
1.76
2.29
0.22
0.09
0.13
IC выравнивания равно 7,54. Для обучающего набора последовательностей была построена LOGO-диаграмма с помощью сервиса WebLOGO. Особо консервативных участков перед старт-кодоном не наблюдается; только А в [-3] позиции и С в [-1] позиции. В целом, заметно соответствие полученного результата консенсусу GCCRCCATG[4].
Рис. 3. LOGO для обучающего набора.
Задание 4
Сайты GAATTC в геноме E. coli
В качестве генома была взята последовательность хромосомыEscherichia coli, штамм O157:H7 str. Sakai. Для обработки последовательности использовался скрипт; по результатам его работы составлена таблица (Таблица 4):
Длина одной последовательности
7 890 332
100%
Число А
1 954 504
24,8%
Число Т
1 947 037
24,7%
Число G
1 990 105
25,2%
Число С
1 998 686
25,3%
Число GAATTC
1133
-
Исходя из этих данных, можно определить ожидаемое число сайтов, умножив длину генома на частоты букв в мотиве. Оно равно 1887,6. Для определения достоверности отличия был проведён Z-тест. В качестве нулевой гипотезы принято утверждение о том, что среднее число сайтов GAATTC равно 1887,6 (ожидаемому). По результатам Z-теста p-value = 7.89782e-79. Это говорит о том, что имеющееся отличие имеет статистическую значимость, и нулевая гипотеза может быть отвергнута.
Литература:
Genetics A Conceptual Approach, Benjamin Pierce (Baylor U.), Ch.13, P.363.
Курс молекулярной биологии на ФББ.
B.Y. Chang, Y.T. Shyu, R.H. Doi, The interaction between Bacillus subtilis sigma-A (sigma A) factor and RNA polymerase with promoters, Biochimie, 1992.
Adams B., Fodor A., Koppenhöfer H., Stackebrandt E., Stock S.P., Klein M., Reprint of “Biodiversity and systematics of nematode–bacterium entomopathogens” [Biol. Control 37 (2006) 32–49], Biological Control, 2006.
Kozak M., An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs, Nucleic acids research, 1987.
