Реконструкция филогенетических деревьев по нуклеотидным последовательностям, укоренение, бутстрэп

В текущем практикуме предлагалось по нуклеотидным последовательностям 12S рРНК малой субъединицы митохондриальной рибосомы выбранных в первом практикуме животных реконструировать филогенетическое дерево с последующим укоренением во внешнюю группу, представляющую собой искусственно добавленное животное, не относящееся к самому нижнему таксону из тех, к которым принадлежат все ранее выбранные животные. В конце предлагалось провести поддержку бутстрэпа получившегося дерева для оценки достоверности ветвей.

Реконструкция деревьев по последовательностям 12S рРНК малой субъединицы митохондриальной рибосомы

С помощью программ fastme с использованием дефолтной эволюционной модели нуклеотидных замен F84 и IQ-Tree по нуклеотидным последовательностям 12S рРНК малой субъединицы митохондриальной рибосомы были построены филогенетические деревья выбранных ранее животных (см. Рис. 1., Рис. 2.). Для этого были вырезаны в отдельные файлы последовательности 12S рРНК из митохондриального генома каждого из анализируемых видов, после чего было проведено множественное выравнивание полученных последовательностей алгоритмом MUSCLE. Ниже приведены команды, с помощью которых были созданы файлы, хранящие данные о деревьях в формате скобочных последовательностей Newick.

fastme -i 12S_rRNA_alignment.phy -o 12S_rRNA_tree.nwk -d
iqtree -s 12S_rRNA_alignment.phy
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное программой fastme с моделью F84. Укоренение осуществлялось в среднюю точку.
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное программой IQ-Tree. Укоренение осуществлялось в среднюю точку.

По рисункам 1 и 2 видно, что деревья, построенные обеими моделями, заметно отличаются от деревьев, построенных по таксономии (см. Практикум 1) и по последовательностям митохондриального белка цитохрома B (см. Практикум 2.). Так, на дереве, построенном с помощью программы fastme, вид TURTR объединён в одну кладу с видами DELDE и DELCA, а на дереве, построенном с помощью IQ-Tree, вид TURAD объединён с теми же видами, в то время как на дереве, построенном по таксономии, клада, содержащая виды TURTR и TURAD, и клада, содежащая виды DELDE и DELCA, должны быть сестринскими друг по отношению к другу. Также нетрудно заметить, что на дереве с Рисунка 1 вид MEGNO объединён в одну кладу с BALBO, хотя на дереве, построенном по таксономии, BALBO объединён в одну кладу с BALAC, а MEGNO является сестринской по отношению к этой кладе видом. На дереве с Рисунка 2 виды BALBO и BALAC корректно объединены в одну кладу, однако теперь вид MEGNO представляет собой неразрешённую ветвь.

Построение дерева с укоренением во внешнюю группу

Далее, необходимо было выбрать животное, которое могло бы служить внешней группой по отношению ко всем ранее выбранным животным. В данном случае таким видом оказался Hippopotamus amphibius, или Бегемот обыкновенный (см. Рис. 3., Рис. 4.).

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное программой fastme с моделью F84, укоренённое во внешнюю группу Hippopotamus amphibius (HIPAM).
Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное программой IQ-Tree с укоренение во внешнюю группу Hippopotamus amphibius (HIPAM).

По рисункам 3 и 4 видно, что на дереве, построенном программой fastme, остались те же самые ошибки: вид TURTR объединён в одну кладу с видами DELDE и DELCA, а вид MEGNO находится в одной кладе с видом BALBO. Кроме того, появилась новая ошибка: клада, состоящая из видов PHYMC, KOGSI, KOGBR, объединилась в одну кладу с видами CAPMR, BALAC, MEGNO, BALBO, BALMY, EUBAS, EUBGL, в то время как на исходном дереве, построенном по таксономии, эта клада объединена с кладой из видов TURTR, TURAD, DELDE и DELCA. Однако на дереве, построенном программой IQ-Tree, стало на одну ошибку реконструкции меньше: вид TURAD объединился с видами DELDE и DELCA.

Бутстрэп-анализ

В конце были воспроизведены филогенетические деревья, построенные программой fastme, содержащие и не содержащие (см. Рис. 1, Рис. 3.) внешнюю группу, с указанием значений поддержки бутстрэпа для каждой из ветвей (см. Рис. 5, Рис. 6.). Команды, использовавшиеся для указания поддержки бутстрэпа с использованием 100 реплик, приведены ниже. 

fastme -i 12S_rRNA_alignment.phy -o 12S_rRNA_tree_bootstrap.nwk -d -b 100
fastme -i 12S_rRNA_outgroup_alignment.phy -o 12S_rRNA_outgroup_tree_bootstrap.nwk -d -b 100

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное программой fastme с поддержкой бутстрэпа.
Рис. 6. Филогенетическое дерево, содержащее внешнюю группу, построенное программой fastme с поддержкой бутстрэпа.

По рисункам 5 и 6 видно, что ветви, реконструированные верно, то есть совпадающие с таковыми на дереве, построенном по таксономии, имеют поддержку бутстрэпа равную 100 или очень близкую к этому значению. Исключение составляет ветвь, содержащую виды DELDE и DELCE: несмотря на то, что клада реконструирована правильно, она всё равно имеет довольно низкую поддержку бутстрэпа. Это может быть обусловлено тем, что ген митохондриальной 12S рРНК довольно короткий (меньше 1000 пар нуклеотидов), из-за чего может не хватать данных для увеличения значения поддержки.

Таким образом, из трёх проделанных практических работ можно сделать вывод о том, что для достоверной реконструкции филогении необходимо использовать несколько молекулярно-генетических маркёров, обладающих свойствами консервативности и универсальности.