PUBMED

Ссылка на мою коллекцию статей

Немного о функции белка MDM2

Белок MDM2, кодируемый геном mouse double minute-2 (mdm2) или его человеческим гомологом, является онкопротеином. В злокачественных опухолях чрезмерно экспрессируется. Так же MDM2 может инактивировать некоторые функции онкосупрессора p53 и разрушать его.

р53 – является транскрипционным фактором, регулирующим жизненный цикл клетки, опухолевым супрессором. Активируется при накоплении повреждений ДНК. Результатом активации р53 является остановка клеточного цикла и репликации ДНК; при сильном стрессовом сигнале — запуск апоптоза. Активированный p53 стимулирует экспрессию гена mdm2.

MDM2 является E3-лигазой и относится к группе E3 системы убиквитин-зависимого протеолиза. Он убиквитинирует белок p53, то есть присоединяет к белку «цепочки» молекул убиквитина. Полиубиквитиновая цепочка является сигналом, свидетельствующим о том, что данный белок подлежит деградации.

В нестрессовых условиях MDM2 вступает в комплекс с p53 и разрушает его. Несмотря на онкогенетическую роль, MDM2 мыши или человека могут блокировать переход клеток от фазы G0 (периода покоя) к фазе G1 (пресинтетический период - непосредственно за делением). Белок имеет 3 домена, которые блокируют переход. Возможно, белок принадлежит к группе онкопротеинов, которые требуются для роста пролиферации нормальных клеток и строгого контроля функций.

(источник: http://mcr.aacrjournals.org/content/1/14/1009.long)

Описание экспериментальной статьи

Yi Pan2 and Dale S. Haines. The Pathway Regulating MDM2 Protein Degradation Can Be Altered in Human Leukemic Cells

http://cancerres.aacrjournals.org/content/59/9/2064.long)

В настоящее время очень мало известно о том, какие клеточные сигналы регулируют экспрессию белка MDM2. Белок MDM2 является природным ингибитором Р53, при избытке он способен связывать супрессор опухолевого роста р53 и блокировать Р53. Домен белка MDM2 связывается с трансактивирующим доменом белка р53 и осуществляется протеолиз молекул белка р53. Повышенная экспрессия белка MDM2 является онкогенным фактором.

В связи с этим важно понять механизмы, которые регулируют экспрессию MDM2 и как эти механизмы могут быть изменены в опухолевых клетках человека. Авторами статьи была исследована зависимость экспрессии белка MDM2 от его стабильности в лейкемичных клетках человека.

Они рассмотрели следующие линии клеток: линия 8166 (T-лимфоциты) обладающая диким типом аллеля гена p53; линии CEM (T-лимфоциты), HEL (эритролейкемия), Jurkat (T-лимфоциты), MOLT4 (T-лимфоциты), Raji(B-лимфоциты), обладающие мутантными аллелями гена p53. Мононуклеарные клетки периферической крови были изолированы с помощью Ficoll-Paque (Pharmacia), согласно инструкциям производителя. Сначала они были выделены с помощью Ficoll-Paque, культивированы в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS (эмбриональная сыворотка коровы) и 1% пенициллина и стрептомицина. Для этого были отобраны в количестве 2*10^6 клеток на миллилитр и помещены в питательную среду PRMI 1640 с добавлением 1% PHA-M. Через 3 дня рекомбинантный интерлейкин IL-2 (sigma) был добавлен в концентрациях от 0.5 до 1 единиц в миллилитре. Каждый последующий день количество клеток подсчитывалось и составляло 1*10^6 клеток в миллилитре. Как только клетки были выдержаны около 48 часов, они были использованы для исследований.

Были проведены эксперименты по определению длительности полураспада белков MDM2 и р53 в пролиферирующих мононуклеарных клетках крови и в клетках, находящихся в состоянии покоя. Также был оценен период полураспада MDM2 в лейкозных клетках человека. Длительность полураспада была оценена путем определения уровня белка в различные моменты времени после воздействия циклогексимидином, который является ингибитор синтеза белка для всех рассматриваемых линий клеток.

Для определения белков использовался анализ Вестерна. Клетки были лизированы в TENN буфере [50 mM Tris (pH 7.4), 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.5% NP40 и 150 mM NaCl], в который были добавлены 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 мкг/мл aprotinin, 2 мкг/мл leupeptin, 1 мкг/мл ингибитор трипсина сои и 1 мкг/мл pepstatin A. Продукты лизиса были очищены центрифугированием, концентрация протеинов была измерена с помощью метода Бладфорда. Образцы белка были перемешаны с додецилсульфатом натрия (4 x SDS-PAGE), прокипячены, отделены на SDS-полиакриламидный гель, перенесены на нитроцеллюлозную мембрану. Белковые пятна были зондированы с 0,5 мкг/мл p53 (DO-1; Calbiochem), 3 мкг/мл MDM2 (IF2; Calbiochem) и актина (0,1 мкг/мл, сигма) антител. Изображение было получено с помощью антител конъюгированных с пероксидазой хрена и усиленной хемилюминесценции (DuPont NEN).

После обработки циклометидином в пролиферирующих клетках количество белка MDM2 уменьшалось гораздо более быстрыми темпами, чем в клетках в стадии покоя. Высокие уровни белка р53 были обнаружены в лейкозных клетках.

В статье также показано, что период полураспада белка MDM2 удлинен в некоторых, но не всех линиях человеческих лейкемических клеток, содержащих мутантный ген p53. Как минимум в одной линии мутантных клеток стабильность MDM2 связана с его большим количеством в клетке. Белок MDM2 накапливается в большем количестве в тех клетках, обработанных ингибитором протеосом, которые содержали нестабильную форму, чем в клетках, обладающих стабильной формой MDM2. Результаты исследования показывают, что экспрессия MDM2 регулируется событиями, которые контролируют стабильность протеина, а в линиях опухолевых клеток эта регуляция изменена.