Мини-обзор бактерии вида
Nitrosomonas eutropha C91

Аннотация

Нитрифицирующие бактерии играют большую роль в формирование экосистем, в связи с их участием в цикле азота. В данной работе будет анализироваться геном одного из представителей нитрифицирующих бактерий из рода Nitrosomonas. Обработав таблицу локальных особенностей генома, а также таблицу с геномом по каждому из репликонов, нами были получены новые сведения о некодирующих областях генома, нуклеотидном составе бактерии и выдвинуты предположения о областях ориджина и терминатора репликации.

Введение

Nitrosomonas eutropha C91 - это грамотрицательная автотрофная нитрифицирующая бета-протеобактерия, окисляющая аммиак(NH₃) в аэробной среде до нитрита(NO₂^-). Обнаруживается в почве с высоким содержанием азота и на очистных сооружениях. По видимому данные бактерии предпочитают среду с высоким содержанием азота. Нитрификация проходит в две стадии. Первая - это окисление аммиака до гидроксиламина(NH₂OH) под воздействием фермента монооксогеназы аммиака(AMO), который требует присутствия в среде кислорода и окислителя в лице убихинона. Вторая стадия протекает благодаря гидроксиламиномоноредуктазе(HAO), гидроксиламин превращается в нитрит, выделяя при этом электроны, половина из которых возвращается в AMO, а оставшаяся часть регенерирует NADH, необходимый для фиксации углерода ^[1]. Несмотря на автотрофность Nitrosomonas eutropha C91 некоторые исследования выявили ее способность к хемотрофии на селективных органических соединениях, что предположительно позволяет использование данный вид бактерии в биоремедиации ^[1]. Еще одним преимуществом данной бактерии является ее устойчивость к тяжелым металлам ^[2]. В связи с наличием у Nitrosomonas eutropha C91 практического применения, бактерия представляет интерес для дальнейшего изучения.

Классификация бактерии Nitrosomonas eutropha C91:
Домен: Bacteria
Отдел: Pseudomonadota
Класс: Betaproteobacteria
Порядок: Nitrosomonadales
Семейство: Nitrosomonadaceae
Род: Nitrosomonas
Вид: Nitrosomonas eutropha C91

Материалы и методы

В данном проекте использовались таблицы с геномом бактерии Nitrosomonas eutropha C91, взятые с сайта The National Center for Biotechnology Information(NCBI). Анализ данных проводился в таких программах как Bash, Google Sheets. Помимо этого применялся язык программирования Python, код был написан с помощью сайта google collaboratory. Для оценки параметра GC-skew использовался сайт GenSkew.

Результаты

Распределение закодированных в геноме белков в соответствии с их длинами:
На основании составленной нами гистограммы (рис. 1) мы можем заметить, что подавляющее число белков состоит из 40-430 аминокислотных остатков, при дальнейшем увеличении длины белка, наблюдается значительный спад их количества Так, начиная с длины белка в 580 а. о. количество разнообразных последовательностей в каждом кармане гистограммы не превышает 30. Белки с длиной более чем 1090 аминокислот были сгруппированы как выбросы, для облегчения анализа гистограммы.

Рис. 1. Гистограмма, оценивающая количество бактериальных белков в зависимости от размеров их аминокислотных последовательностей

Распределение генов белков и различных типов РНК по репликонам:
Из представленной таблицы (см. таблица 1) видно, что в изученной нами бактерии помимо хромосом содержатся два типа плазмид, каждая из которых несет около 60 белок кодирующих участков. Первая плазмида кодирует 59 CDS, а вторая 64, что составляет от общего числа белок кодирующих последовательностей примерно 2.2% и 2.4% соответственно. Несмотря на небольшие размеры, плазмиды в организмах бактерий часто играют большую роль, так, они несут гены помогающие выжить в среде, содержащей различные токсичные вещества. Исследование ^[1] показало выживание бактерий в условиях с содержанием ароматических соединений, а именно крезола, являющегося токсичным для других живых существ. Возможно гены помогающие выжить в таких условиях содержатся в плазмидах. В свою очередь последовательности, кодирующие разнообразные типы РНК содержатся только в хромосомах, что доказывает невозможность существования плазмид в отдельности от клетки.

Таблица 1. Количество различных генов на разных репликонах.

	белок кодирующие последовательности	транспортная РНК	рибосомальная РНК	некодирующие РНК	Трнаспортно матричная РНК
хромосома	2570	41	3	3	1
плазмида p1	59	0	0	0	0
плазмида p2	64	0	0	0	0

Расстояние между белок кодирующими последовательностями на плюс-цепи наибольшей хромосомы

Рис. 2. Диаграмма, оценивающая количественное распределение нуклеотидов, находящихся между двумя белок кодирующими цепями

Данная задача интересна для нас, так как геном, помимо кодирующих последовательностей, включает в себя большое количество регуляторных фрагментов, оказывающих влияние на жизнедеятельность клетки, синтез нерегуляторных РНК, процессы трансляции и транскрипции. Проанализировав приведенную нами гистограмму (рис. 2), можно с легкостью заметить, что подавляющая часть белок кодирующих последовательностей удалены друг от друга на расстоянии от 0 до 50 нуклеотидных пар. При увеличении количества нуклеотидов между CDS идет резкое снижение вероятности такого исхода. Уже при расстоянии от 100 до 150 нуклеотидов, количество таких случаев падает практически в два раза, а начиная с отметки в 450 нуклеотидов частота промежутков не превышает 10, однако стоит заметить, что несмотря на малое количество промежутков со схожей длиной, разнообразие промежутков с увеличением нуклеотидов тоже увеличивается Так, количество расстояний между белок кодирующими последовательностями свыше 450 нуклеотидов составляет 354 случая, что от общего количество (1268 промежутков) практически 30%. Максимально большое расстояние 41152 нуклеотида. Частично объяснить полученные данные можно опираясь на предыдущий пункт, где мы выявили наличие в составе хромосомы участков, кодирующих рибосомальные РНК, транспортные РНК и прочих.Большое количество и разнообразие исследуемых промежутков между CDS указывает на их значимую роль в геноме бактерии. Помимо сверхбольших промежутков, интерес вызывают участки, где перекрываются белок кодирующие фрагменты, в составе кольцевой хромосомы их также большое количество (335 штук) и наибольший из них равен перекрыванию в 53 нуклеотида. Перекрывание генов может говорить об участии их в одном процессе, когда важна совместная регуляции или о последовательном синтезе веществ, играющих роль в одном метаболическом процессе. Интересно также заметить, что некодирующие последовательности составляют в общем 55% от всей кольцевой хромосомы, что сильно меньше чем у эукариот, но больше многих других бактерий.

Рис. 3. Диаграмма, отражающая количество разнообразных промежутков, разделяющих белок кодирующие последовательности двух плазмид, в зависимости от количество нуклеотидов в их составе

Дополнительно нами были проанализированы и сравнены промежутки между белок кодирующими последовательностями у двух плазмид, входящих в состав Nitrosomonas eutropha C91 (см. рис. 3) Несмотря на небольшое количество промежутков в составе плазмид, общий вид диаграммы у них очень схож с таковым у хромосомы бактерии. Однако, можно заметить, что содержание перекрывающихся генов в плазмиде 1 сильно выше, чем в плазмиде 2 и в процентном соотношение к общему числу промежутков превышает таковое у основной кольцевой ДНК, это может говорить о большем участии плазмиды 1 в метаболических путях.

Оценка процентного содержания нуклеотидов по репликонам:
Проанализировав нуклеотидный состав бактерии(таблица 2) мы заметили, что процентное содержание нуклеотидов с аденином и тимином выше, чем GC нуклеотидов, а значит число двойных водородных связей тоже выше, что играет роль при подборе праймера и температуре отжига. Процентное содержание пуринов в среднем составляет 50.263% от общего количеств, что несколько противоречит правилу Чаргаффа, но может быть объяснено наличием модифицированных оснований в геноме.

Таблица 2. Распределение нуклеотидов на каждом из репликонов

	хромосома	плазмида p1	плазмида p2
аденин	25,77%	25,33%	25,57%
тимин	25,75%	24,87%	24,75%
цитозин	24,2%	24,61%	25,03%
гуанин	24,28%	25,19%	24,65%
пурины	50,05%	50,52%	50,22%

Поиск участка ориджина и терминации: Как уже было сказано выше, отличие GC пар от АT заключается в дополнительной водородной связи между ними. Участки с наименьшим содержанием тройных водородных связей, с большей долей вероятности являются участками начала репликации, а участки с наибольшим содержанием этих пар - терминации. Для данного задания был использован показатель GC-skew. Он заключается в оценке соотношения гуанина и цитозина на определенном интервале.
GC-skew = (C - G)/(C + G)
После подсчета GC-skew на интервале берется интеграл функции и по найденным значениям строится график, максимум которого соответствует точке терминации,минимум точке начала репликации.

Рис. 4. График параметра GC-skew для хромосомы

Оценка нуклеотидного состава хромосомы (рис. 4) показала, что точке ориджина соответствует участок близ 101118 нуклеотида, а точке репликации около 1279941 нуклеотида. Дополнительно нами была проведена оценка для каждой из плазмид.

Рис. 5. График параметра GC-skew для плазмиды p1

Рис. 6. График параметра GC-skew для плазмиды p2

Плазмида p1(рис. 5) хоть и имела менее выраженные пики на графике (возможно из-за меньшего нуклеотидного состава плазмиды), все же показала достаточно релевантные данные. Точка ориджина - это окрестность 37200 нуклеотида, а точка терминации - 64900 нуклеотида. Вывод о правдивость полученных данных мы сделали на основании знаниях о процессах протекания репликации. После начала репликации, ДНК-полимеразы движутся в две разные стороны от точки репликации и встречаются примерно на противоположном конце кольцевой ДНК, в точке терминации. Полученные нами данные совпадают с данной концепцией. Однако оценка GC-skew для плазмиды p2 (рис. 6) продемонстрировала другие результаты, согласно графику точка начала репликации и конца слишком близки, что маловероятно. Из этого можем сделать вывод, что данный метод оценки подходит не для всех геномов.

Заключение

В данном обзоре нами были получены новые данные о геноме бактерии Nitrosomonas eutropha C91, в частности установлен нуклеотидный состав генома, выявлены предположительные области ориджина и терминатора для репликонов, получены сведения о некодирующих областях генома и о размерах протеома. По мнению автора, бактерия интересна для дальнейшего изучения, в связи с недостатком данных о протеоме бактерии и участии плазмид бактерии в физиологических процессах.

Сопроводительные материалы