Анализ ГТФ-3′,8-циклазы бактерии Octadecabacter antarcticus 307

Выбор белка и общая информация

Поиск аннотированных белков бактерии Octadecabacter antarcticus 307 осуществлялся при помощи запроса organism_id:391626 (Organism: Octadecabacter anatarcticus 307). Стоит отметить, что все белки в базе данных UniProtKB для данной бактерии аннотированы автоматически и не были проверены вручную.

Для дальнейшей работы был выбран относительно хорошо аннотированный белок (Annotation score: 3, для Octadecabacter antarcticus 307 отсутствуют белки с Annotation score больше 4) с ID M9R2Y3_9RHOB - ГТФ-3′,8-циклаза, фермент, осуществляющий катализ образования дополнительного цикла в молекуле гуанозинтрифосфата по SAM-радикальному механизму (Рис. 1). Данная реакция является частью пути биосинтеза молибдоптерина (Рис. 2).

Последовательность данного белка состоит из 334 аминокислотных остатков, а молекулярная масса составлет примерно 38 кДа. Фермент содержит 2 железо-серных кластера (4Fe-4S) в качестве кофактора, а также имеет сайты связывания S-аденозилметионина (SAM) и ГТФ.

Кластеры похожих белков

Для анализируемого белка кластер UniRef100 содержал только последовательность данного фермента, UniRef90 - 3 белковые последовательности, UniRef50 - 3327 последовательностей.

Можно предположить, что размеры кластеров могут быть использованы для оценки распространенности и консервативности белка: размеры кластеров положительно коррелируют с распространенностью, а отношения размеров UniRef100 к UniRef90, UniRef100 к UniRef50 и UniRef90 к UniRef50 - с консервативностью белка.

Для проверки этого предположения можно проанализировать кластеры похожих последовательностей для консервативных белковых продуктов генов домашнего хозяйства рассматриваемой бактерии (Табл. 1).

Как можно видеть из таблицы, очевидной корреляции между отношениями размеров кластеров и консервативностью белка, а также между размерами кластеров и распространенностью белка не наблюдается. Так количество записей в кластерах для ГТФ-3′,8-циклазы в 2 раза превышает таковое для генов домашнего хозяйства, а отношения между размерами кластеров для генов домашнего хозяйства явно не отличаются от таковых для анализируемого белка. Это объяснимо, поскольку большая часть записей в UniProtKB созданы и аннотированы автоматически и не проверены людьми.

Таким образом, несмотря на то, что распространенность и консервативность белка влияет на размеры кластеров похожих последовательностей, сами по себе размеры кластеров являются плохими маркерами для оценки обсуждаемых показателей.

Поиск связанных белков

1. Поиск ферментов различных классов, использующих S-аденозилметионин (SAM) при катализе, в роде Octadecabacter. Для поиска использовались следующие запросы: (keyword:KW-0949) AND (ec:N) AND (taxonomy_id:53945), где N - номер класса фермента.

Среди оксидоредуктаз (EC: 1) было обнаружено 13 записей, соответствующих запросу. В них описываются белки, участвующие в анаболизме тетрапирролов, например, копропорфириноген-III-оксидаза (S-аденозилметионин в данном случае выступает как один из субстратов реакции).

В базе данных UniProtKB были найдены 254 записи, соответствующие трансферазам (EC: 2). Большая часть записей включает описание ферментов-метилтрансфераз, что ожидаемо, поскольку SAM - один из самых распространенных переносчиков метильных групп. Однако среди результатов имелись и такие ферменты, как биотинсинтаза и липоилсинтаза, осуществляющие катализ по SAM-радикальному механизму [2, 3].

Гидролазы (EC: 3), соответствующие запросу, обнаружены не были. Однако для других бактерий были обнаружены ферменты, содержащие SAM в роли кофактора (запрос: (cc_cofactor_chebi:"CHEBI:15414") AND (ec:3)), к примеру, эндонуклеазы рестрикции типа III.

Для лиаз (EC: 4), были найдены 12 записей, 6 из которых соответствовали ГТФ-3′,8-циклазе различных видов рода Octadecabacter.

Изомеразы (EC: 5) и лигазы (EC: 6), удовлетворяющие условиям запроса, отсутствовали.

2. Поиск ферментов Octadecabacter antarcticus 307, содержащих молибдоптерин в качестве кофактора. Поисковый запрос выглядел следующим образом: (organism_id:391626) AND (cc_cofactor_chebi:"CHEBI:25372") AND (taxonomy_id:53945).

Данному запросу соответствуют 2 записи в UniProtKB: каталитическая субъединица метионинсульфоксидредуктазы, восстанавливающая окисленные остатки метионина мембранных белков за счет электронов из пула хинонов дыхательной цепи, и нитратредуктаза.

3. Поиск других ферментов Octadecabacter antarcticus 307, участвующих в биосинтезе молибдоптерина. Поисковый запрос выглядел следующим образом: (organism_id:391626) AND (cc_pathway:"molybdopterin biosynthesis").

Помимо ГТФ-3′,8-циклазы (moaA2) по данному запросу были найдены 4 записи: синтаза циклического пираноптерина (moaC); каталитическая субъединица молибдоптеринсинтазы (moaE); белок, участвующий в биосинтезе молибдоптерина, B (moaB) и молибдоптерин-молибдентрансфераза (moeA). Однако, в пути биосинтеза молибдопетрина участвуют также ферменты, кодируемые генами moaD, moeB и mogA (Рис. 2).

Гены moaD и moeB были найдены отдельными поисковыми запросами: (organism_id:391626) AND (gene:moaD) для moaD и (organism_id:391626) AND (gene:moeB) для moeB. Однако эти белки плохо аннотированы (Annotation score: 1) и для них не указаны метаболические пути, в которых они принимают участие. Ген mogA найден не был.

Поиск источника аннотации

Поиск значений кодов ECO осуществлялся при помощи сервиса EMBL-EBI Ontology Lookup Service

В качестве функции рассматриваемого белка указан катализ циклизации ГТФ в (8S)-3′,8-цикло-7,8-дигидрогуанозин 5′-трифосфат, код ECO:0000256. Данный код указывает на то, что в качестве доказательства автоматически созданого утверждения используется совпадение с модельной последовательностью (match to sequence model evidence used in automatic assertion). Далее указан код "правила" (HAMAP-Rule), в соответствии с которым алгоритм HAMAP определил функцию анализируемого фермента. Так в HAMAP rule MF_01225 имеются 4 шаблонные проверенные вручную последовательности ГТФ-3′,8-циклаз других бактерий.

Ген кодирующий ГТФ-3′,8-циклазу имеет название moaA2, для этой информации указан код ECO:0000313, который является маркером того, что данные, использованные для автоматического утверждения, были импортированы из внешнего источника (imported information used in automatic assertion). Далее дана ссылка на запись в базе данных EMBL-EBI.

Для рассматриваемого белка в таблице геномных особенностей указано наличие домена, принимающего участие в реализации SAM-радикального механизма. В данном случае указан код ECO:000259, что говорит о том, что как доказательство в автоматически созданном утверждении было использовано соответствие белка предсказательной модели в базе данных InterPro. Далее дана ссылка на профиль данного домена в базе данных PROSITE.

ЛИТЕРАТУРА И ИСТОЧНИКИ

1. Hover, Bradley M. and Ken Yokoyama. “C-Terminal glycine-gated radical initiation by GTP 3',8-cyclase in the molybdenum cofactor biosynthesis.” Journal of the American Chemical Society 137 9 (2015): 3352-9.

2. Lin, Steven & Cronan, John. (2011). Closing in on complete pathways of biotin biosynthesis. Molecular bioSystems. 7. 1811-21. 10.1039/c1mb05022b.

3. Neti, Syam & Sil, Debangsu & Warui, Douglas & Esakova, Olga & Solinski, Amy & Serrano, Dante & Krebs, Carsten & Booker, Squire. (2022). Characterization of LipS1 and LipS2 from Thermococcus kodakarensis : Proteins Annotated as Biotin Synthases, which Together Catalyze Formation of the Lipoyl Cofactor. ACS Bio & Med Chem Au. 2. 10.1021/acsbiomedchemau.2c00018.

4. Angad P. Mehta, Sameh H. Abdelwahed, Tadhg P. Begley, Molybdopterin biosynthesis—Mechanistic studies on a novel MoaA catalyzed insertion of a purine carbon into the ribose of GTP, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, Volume 1854, Issue 9, 2015, Pages 1073-1077, ISSN 1570-9639, https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2015.04.008.