8 (926) 907 94 08

Всё на свете является чудом!

A- и В- формы ДНК. Структура РНК

Задание 1. Построение модели структур A-, B- и Z-формы ДНК с помощью инструментов пакета 3DNA

При помощи программы Putty мы подсоединились к серверу kodomo.cmm.msu.ru, после чего перешли в рабочую директорию командой cd Term3/Practice2, предварительно создав эту директорию командой mkdir Practice2.

Для указания пути к 3DNA мы ввели команды: export PATH=${PATH}:/home/preps/golovin/progs/X3DNA/bin и
export X3DNA=/home/preps/golovin/progs/X3DNA.

Далее с помощью программы fiber пакета 3DNA командой fiber -* gatc-*.pdb, где "*" соответствует необходимой форме (a, b и z), мы построили, а затем и сохранили три формы дуплекса ДНК: А-форму, В-форму и Z-форму.

Задание 2. Работа со структурами нуклеиновых кислот средствами Rasmol

Упражнение #1 (выделение разных атомов и химических группировок, используя предопределенные множества RasMol)

Применяя скрипты последовательно для каждой формы дуплекса ДНК, мы получаем различные изображения:

1. сахарофосфатный остов ДНК

background white
zoom 100
restrict none
select backbone
wireframe 60
rotate y 90

→ для gatc-a
→ для gatc-b
→ для gatc-z

2. все нуклеотиды

background white
zoom 100
restrict none
select A
color red
wireframe 60
select G
color blue
wireframe 60
select T
color yellow
wireframe 60
select C
color green
wireframe 60
rotate y 90

→ для gtac-a
→ для gtac-b
→ для gtac-z (как мы видим, аденина и тимина в z-форме нет)

3. все аденины

background white
zoom 100
restrict none
select backbone
color orange
backbone 40
select A
color red
wireframe 60
rotate y 90

→ для gtac-a
→ для gtac-b
→ для gtac-z (ещё раз убеждаемся, что аденин в z-форме отсутствует)

4.1 атом N7 во всех гуанинах

background white
zoom 100
restrict none
select backbone
color grey
backbone 40
select G
color blue
spacefill 50
wireframe 60
select G and *.N7
spacefill 150
color yellow
rotate y 90

→ для gtac-a
→ для gtac-b
→ для gtac-z

4.2 атом N7 в первом по последовательности гуанине

background white
zoom 100
restrict none
select backbone
color grey
backbone 40
select G
color blue
spacefill 50
wireframe 60
select G1 and *.N7
spacefill 150
color yellow
rotate y 90

→ для gtac-a
→ для gtac-b
→ для gtac-z

Упражнение #2 (получение файлов PDB)

На сайте PDB мы нашли документы, соответствующие заданным идентификаторам PDB, и сохранили их в формате pdb: 1QTQ.pdb и 1LRR.pdb.

Упражнение #3 (проверка заданных структур ДНК и РНК на наличие разрывов)

При проверке заданных структур 1QTQ и 1LRR разрывов обнаружено не было.
1QTQ и 1LRR в проволочной модели:

rna

→ RNA (1QTQ) dna

→ DNA (1LRR)

В завершении сохранили координаты атомов только ДНК и РНК в отдельных файлах.

Задание 3. Сравнение структур 3-х форм ДНК с помощью средств RasMol

Упражнение #1 (работа с большой и малой бороздками)

В Rasmol открыли файл gatc-b.pdb (B-форма).

Визуально определили и отметили большую (отмечена синей стрелочкой)
и малую (выделена жёлтым цветом) бороздки.

На рисунке видно, что большая бороздка явно глубже малой.

Затем мы выбрали заданное азотистое основание (тимин) в произвольном месте структуры (T15 в цепи A). После чего выделили его и поработали с простейшими командами, чтобы лучше увидеть расположение атомов.

Определили, что:

○ в сторону большой бороздки обращены атомы
- T15.C4, T15.C5, T15.C5M, T15.C6 и T15.

○ в сторону малой бороздки обращены атомы
- T15.C2, T15.O2, T15.N3

○ примерно посередине находится атом T15.N1 (несмотря на небольшое сдвижение в сторону малой бороздки)

С помощью ChemSketch получили изображение нашего основания
и определённым образом раскрасили атомы, смотрящие в сторону большой и малой бороздок.

То же проделали с формами "A" и "Z".

Для формы A: в сторону большой бороздки в этой форме обращены все основания, и тимин в том числе, но в сторону малой бороздки немного повёрнуты атомы: T15.C4, T15.C5, T15.C5M, T15.C6 и T15.O4 (лишь повёрнуты, не обращены).

Для формы B: к сожалению, в этой форме не нашлось тимина, так как в ней представлены только цитозин и гуанин, поэтому взяли другой пиримидин вместо тимина - цитозин. При его изучении увидели, что в сторону большой бороздки обращены атомы C6.C2, C6.N3 и С6.O2, а в сторону малой бороздки - атомы C6.C5 и C6.C6. Примерно посередине находятся атомы С6.N1, С6.C4 и С6.N4.

Упражнение #2 (сравнение основных спиральных параметров разных форм ДНК)

	А-форма	В-форма	Z-форма
Тип спирали	Правая	Правая	Левая
Шаг спирали (Å)	28.03	33.75	43.50
Число оснований на виток	11	10	12
Ширина большой бороздки (Å)	16.81 (по аденину)	17.21 (по гуанину)	7.20 (по гуанину)
Ширина малой бороздки (Å)	7.98 (по аденину)	11.69 (по аденину)	18.30 (по цитозину)

Упражнение #3 (сравнение торсионных углов в структурах А- и В-форм)

	α (P-O5')	β (O5'-C5')	γ (C5'-C4')	δ (C4'-C3')	ε (C3'-O3')	ζ (O3'-P)	χ (C1'-N)
А-ДНК	-51.68^o	174.79^o	41.73^o	79.05^o или -161.74^o	100.35^o	-75.10^o	-94.92^o
В-ДНК	-29.91^o	136.33^o	31.16^o	143.34^o или -92.87^o	105.81^o	-160.49^o	-34.34^o

Полученные значения торсионных углов сильно отличаются от значений, приведенных в презентации, так как углы измерялись для тимина, а не для гуанина. Однако соотношение между углами А- и В-форм ДНК примерно соответствует такому соотношению для гуанина: углы α, β, γ, χ острее в В-форме, углы δ и ξ острее в А-форме.

Задание 4. Определение параметров структур нуклеиновых кислот с помощью программ пакета 3DNA

Упражнение #1 (определение торсионных углов нуклеотидов)

Командой find_pair -t gatc-*.pdb stdout | analyze (изменяя * на a, b, z), мы записали информацию о различных параметрах структур трёх форм ДНК в файлы gatc-*.out
Значения торсионных углов A-, B- и Z-форм выделили в отдельный файл.

Сравнивая значения соответствующих торсионных углов в структурах A-, B- и Z-форм ДНК, мы определили, что больше всего различаются значения углов:
○ A- и B-формы - δ и χ
○ A- и Z-формы - α
○ A- и Z-формы - α, χ и ξ

Командой remediator --old "XXXX.pdb" > "XXXX_old.pdb" сделали перевод pdb-файлов РНК и ДНК в старый формат, который приемлем для работы с программами пакета 3DNA.
Значения торсионных углов тРНК выделили в отдельный файл. При рассмотрении торсионных углов можно отметить сходство тРНК с A-формой ДНК.

Упражнение #2 (определение структуры водородных связей)

При помощи уже изученной программы find_pair из пакета 3DNA, мы определили возможные связи между азотистыми основаниями, получив на выходе файл с информацией.

Исходя из полученных данных выяснили:
○ акцепторный стебель состоит из участка 902-907 и комплементарного ему участка 966-971
○ T-стебель состоит из участка 949-953 и комплементарного ему участка 961-965
○ D-стебель состоит из участка 910-912 и комплементарного ему участка 923-925
○ антикодоновый стебель состоит из участка 926-933 и комплементарного ему участка 937-944

Используя RasMol, получили изображение остова исследуемой тРНК, где акцепторный стебель выделен красным, T-стебель - зелёным, D-стебель - синим, антикодоновый - оранжевым.

zap
load 1QTQ.PDB
background white
select all
color grey
backbone 100
wireframe off
select 902-907:B, 966-971:B
color red
select 949-953:B, 961-965:B
color green
select 910-912:B, 923-925:B
color blue
select 926-933:B, 937-944:B
color orange

В структуре отсутствуют тимидин (в T-петле) и дигидроуридины (в D-петле), но присутствует вариабельная петля (945-948).

Структуру стеблевых дуплексов поддерживают 19 канонических и 9 неканонических пар оснований.

Список неканонических пар:
1. U954 - A958
2. U955 - G918
3. A937 - U933
4. U938 - U932
5. C940 - G930
6. C944 - A926
7. A913 - A945
8. A914 - U908
9. G915 - C948

Несмотря на наличие, казалось бы, канонических пар (G-C и A-U) среди неканонических, взаимодействия между этими основаниями не являются уотсон-криковскими из-за водородных связей между другими атомами.

Пример 2-х из 9-ти неканонических пар (2 и 7)

Исследуемая тРНК осуществляет транспорт глутаминовой кислоты. Она кодируется двумя триплетами: CAA и CAG. Следовательно возможные антикодоны - GUU и GUC. В антикодоновой петле исследуемой тРНК есть триплет GUC - это участок 934-936, представляющий собой антикодоновую петлю.

Что касается стабилизации третичной структуры тРНК, то присутствуют многочисленные дополнительные водородные связи, например, между основаниями D- и Т-петель есть две дополнительные водородные связи, одна из которых представляет собой каноническое взаимодействие (G919 - C956), другая - неканоническое (U955 - G918):

  13   (0.004) B:.955_:[..U]Ux**+xG[..G]:.918_:B (0.013)     x
  28   (0.008) B:.919_:[..G]G-----C[..C]:.956_:B (0.003)     +

Упражнение #3 (поиск стекинг-взаимодействий)

Рассмотрим несколько возможных вариантов:

1) Стекинг-взаимодействия между основаниями конца акцепторного стебля и начала Т-стебля (это позиции 907-949 и им комплементарные 966-965):

   6   (0.004) B:.907_:[..A]Ax----U[..U]:.966_:B (0.002)     |
   7   (0.002) B:.949_:[..C]C-----G[..G]:.965_:B (0.003)     |

Значения площадей перекрывания для этих пар такие:

     step      i1-i2        i1-j2        j1-i2        j1-j2        sum
   6 AC/GU  2.22( 1.10)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  5.96( 3.01)  8.18( 4.11)

Как видим, перекрывание довольно значительное, и стекинг-взаимодействие вполне может присутствовать. Это иллюстрирует изображение, полученное с помощью команды stack2img:

2) Стекинг-взаимодействия между антикодоновым и D-стеблем (это позиции 944-910 и им комплементарные 926-925):

  21   (0.005) B:.944_:[..C]Cx*---A[..A]:.926_:B (0.009)     |
  22   (0.005) B:.910_:[..G]G-----C[..C]:.925_:B (0.003)     |

Значения площадей перекрывания для этих пар:

    step      i1-i2        i1-j2        j1-i2        j1-j2        sum
  21 CG/CA  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.94( 0.28)  0.95( 0.28)

Как видим, перекрывание довольно небольшое, поэтому вероятность стекинг-взаимодействия чрезвычайно мала. Это подтверждает изображение: