Программа B L A S T

BLAST (англ. Basic Local Alignment Search Tool) — семейство компьютерных программ, служащих для поиска гомологов белков или нуклеиновых кислот, для которых известна первичная структура (последовательность) или её фрагмент. Используя BLAST, исследователь может сравнить имеющуюся у него последовательность с последовательностями из базы данных и найти последовательности предполагаемых гомологов. Является важнейшим инструментом для молекулярных биологов, биоинформатиков, систематиков.

Для выполнения упражнений воспользуемся web-интерфейсом к программе BLASTP на сервере NCBI. Заходим на страницу с программой BLASTP, после чего в разделе "Basic BLAST" переходим по гиперссылке "protein blast".

basic_blast

Программа BLASTP относится к белковой группе программ серии BLAST, предназначенной для сравнения изучаемой аминокислотной последовательности белка с имеющейся базой данных белков и их участков.

Конкретно BLASTP позволяет найти все сходные последовательности (подробнее о программе BLAST).

1. Поиск гипотетических гомологов белка THIS_BACSU в разных банках

- заходим на веб-страницу, где реализована программа BLASTP, и в поле "Enter Query Sequence" вписываем код доступа - AC O31617 - белка THIS_BACSU

- затем проводим поиск гомологов в банках Swiss-Prot, PDB (Protein Data Bank proteins) и nr (Non-redundant protein sequences) - для этого изменяем значение параметра "database"

- закончив поиски, заполняем таблицу

	Поиск по Swiss-Prot	Поиск по PDB	Поиск по "nr"
1. Лучшая находка (соответствует с заданным для поиска белком)
Accession	O31617.1	1 TYG_B	1 TYG_B
E-value	1,00E-40	4,00E-42	2,00E-39
Вес (в битах)	133 bits	134 bits	134 bits
Процент идентичности	100%	100%	100%
2. Сколько хороших кандидатов в гомологи найдено? (число находок в списке описаний с E-value < 1e-10)	0	0	32
3. "Худшая из удовлетворительных" находка (последняя в выдаче с E-value < 1)
Номер находки в списке описаний	8	2	644
Accession	Q2RRL3.2	1 RYJ_A	ZP_05551609.1
E-value	0,74	0,1	0,99
Вес (в битах)	30.4 bits	28.1 bits	32.7 bits
% идентичности	46%	27%	37%
% сходства	65%	55%	61%
Длина выравнивания	289	70	68
Координаты выравнивания (от-до, в запросе и в находке)	В запросе: 41-66	В запросе: 65-66	В запросе: 56-66
Координаты выравнивания (от-до, в запросе и в находке)	В находке: 1-26	В находке: 69-70	В находке: 54-64
Число гэпов	0	4	12

- исходный белок THIS_BACSU удалось найти в Swiss-Prot и nr, а в банке PDB нашли структуру белка

- при поиске явных гомологов (E-value < 1e-10) в базе данных Swiss-Prot их должно быть меньше, чем в nr, но больше, чем в PDB. Это обусловлено тем, что банки сильно отличаются числом имеющихся последовательностей. В банке nr более 17 млн последовательностей, а у Swiss-Prot и PDB около 450000 и 57000 соответственно. Увы, в нашем случае мы вообще не нашли явных гомологов, ни в Swissprot, ни в nr.

- всего находок мы получаем: 26-Swiss_Prot, 8-PDB, 734-nr. Для Swiss-Prot и PDB мы ограничиваем количество находок значением E-value (выбрав значение 100, число находок оказывается меньше, чем 100), а для банка nr лимитирующим фактором является предельный размер выдачи, который мы повысили до 1000, и тем самым смогли узнать конечное число находок.

2. Поиск гипотетических гомологов белка THIS_BACSU с фильтром по таксонам

Необходимо найти лучшего гомолога белка THIS_BACSU в организмах таксона, филогенетически как можно более далекого.

Таксономия «Bacillus subtilis» и «Bacillus anthracis»
Bacteria	царство	Eukaryota
Firmicutes	отдел	Actinobacteria
Bacilli	класс	Clostridia
Bacillales	порядок	Lactobacillales
Bacillaceae	семейство	Listeriaceae
Bacillus	род	Geobacillus
Bacillus subtilis	вид	Bacillus anthracis

- для поиска гомолога белка THIS_BACSU в банке Swiss-Prot вводим название таксона в окошко "Organism"

- проверяем на наличие гипотетического гомолога (критерий: E-value < 0,001) в порядке приближения к "Bacillus subtilis"

- во время первого же поиска в царстве Eukaryota натыкаемся на интересующий нас гомолог

Интересующая информация	Результат поиска по Swiss-Prot
Номер находки в списке описаний	1
Accession	P49535.5
E-value	1e-07
Вес (в битах)	39.3 bits
Процент идентичности	30%
Процент сходства	59%
Длина выравнивания	73
Координаты выравнивания	В запросе: 64-66 В находке: 71-73
Число гэпов	1

3. Сравнение выравниваний, выданных программой BLASTP, с оптимальными глобальным и локальным выравниваниями

1) Для сравнения воспользуемся выравниванием последовательностей белков THIS_BACSU (AC O31617) и YCF40_ODOSI (AC P49535), которое было получено с помощью программы BLASTP при выполнении предыдущего задания.

>sp|P49535.1|YCF40_ODOSI  RecName: Full=Uncharacterized protein ycf40
Length=73

GENE ID: 801820 ycf40 | ORF73 [Odontella sinensis]

Score = 39.3 bits (90),  Expect = 1e-07, Method: Compositional matrix adjust.
Identities = 19/63 (30%), Positives = 37/63 (59%), Gaps = 1/63 (2%)

Query  4   LNGKDVKWKKDTGTIQDLLASYQLENKIVIVERNKEIIGKERYHEVELCDRDVIEIVHFV  63
           +NG++  +  +T  + DLL  +   + ++++E N  I  K+ + ++ + + D IEIV  V
Sbjct  12  INGQEY-YTTNTINLHDLLNYFDFNSSLLVLEYNNFICNKKNWEKIMISNNDKIEIVTIV  70

Query  64  GGG  66
           GGG
Sbjct  71  GGG  73

Параметры, использованные в программе BLASTP, применяем и для оптимальных полного и частичного выравниваний.

# Matrix: EBLOSUM62     -> матрица весов замен
# Gap_penalty: 11.0     -> штраф за открытие гэпа
# Extend_penalty: 1.0   -> штраф за удлинение гэпа

2) С помощью программы needle из пакета EMBOSS, построим полное выравнивание для тех же белков THIS_BACSU и YCF40_ODOSI. Для этого написали команду (needle sw:O31617 sw:P49535 O31617_P49535.needle -gapopen 11 -gapextend 1)

THIS_BACSU   1 --------MLQLNGKDVKWKKDTGTIQDLLASYQLENKIVIVERNKEIIG 42
                       ...:||::. :..:|..:.|||..:...:.::::|.|..|..
YCF40_ODOSI  1 MTKISTAKTFFINGQEY-YTTNTINLHDLLNYFDFNSSLLVLEYNNFICN 49

THIS_BACSU  43 KERYHEVELCDRDVIEIVHFVGGG 66
               |:.:.::.:.:.|.||||..||||
YCF40_ODOSI 50 KKNWEKIMISNNDKIEIVTIVGGG 73

3) Теперь при помощи программы water из пакета EMBOSS, строим частичное выравнивание этих белков. Для этого написали команду (water sw:O31617 sw:P49535 O31717_P49535.water -gapopen 11 -gapextend 1)

THIS_BACSU   4 LNGKDVKWKKDTGTIQDLLASYQLENKIVIVERNKEIIGKERYHEVELCD 53
               :||::. :..:|..:.|||..:...:.::::|.|..|..|:.:.::.:.:
YCF40_ODOSI 12 INGQEY-YTTNTINLHDLLNYFDFNSSLLVLEYNNFICNKKNWEKIMISN 60

THIS_BACSU  54 RDVIEIVHFVGGG 66
               .|.||||..||||
YCF40_ODOSI 61 NDKIEIVTIVGGG 73

Получив все три выравнивания, сравним их по определённым параметрам

С р а в н и в а е м ы й п а р а м е т р	BLASTP	needle	water
Длина выравнивания	64	74	64
Вес выравнивания	90	88	92
Процент идентичности	30 %	25,7 %	30,2 %
Процент сходства	59 %	50 %	58,7 %
Число гэпов	1	9	1
Координаты выравнивания	В запросе: 4-66 В находке: 12-73	В запросе: 1-66 В находке: 1-73	В запросе: 4-66 В находке: 12-73

Мерой совпадения двух выравниваний является процент согласованных колонок 1-ого выравнивания относительно общего числа колонок (аналогично и для 2-ого выравнивания).

При расчетах ограничиваемся участками: в запросе 4-66, в находке 12-73.

Рассчитаем меру совпадения локального выравнивания, полученного программой BLASTP, c оптимальными глобальным и частичным выравниваниями:

	BLASTP -\|\|- needle		BLASTP -\|\|- water
Число согласованных колонок	64		64
Общее число колонок	64	64	64	64
Мера совпадения	100%		100%

Выбранный фрагмент оптимального глобального выравнивания составляет 86,5% от общей длины этого глобального выравнивания. А выравнивание, построенное с помощью программы BLASTP, и оптимальное частичное выравнивание абсолютно одинаковые.

1*. Дополнение страницы "Описание программ" (раздел "пакет EMBOSS")

В разделе "EMBOSS" практикума "Описание программ" добавили описания недавно используемых программ:

- seqret

-- matcher

--- stretcher

---- needle

----- water

2*. Поиск с другими параметрами программы BLAST

3*. Гомология находки с E-value>1

4*. Дополнительные интерфейсы к программе BLAST