Множественное выравнивание

1. Выравнивание набора гомологов своего белка

a. Получение 5–10 гомологов своего белка, используя BLAST на NCBI.

- для поиска гомологов белка THIS_BACSU мы запустили BLAST, ограничив выдачу таксоном Bacteria и установив порог на E-value, равный 0,001. Но на выходе мы не то что не получили слишком родственных белков, у нас вообще ничего не нашлось. Поэтому продолжили поиск уже другим способом.

- если в первом случае мы искали по SwissProt, то уже после отсутствия находок стали искать по nr и конечно же нашли гомологи. Из огромного количества гомологов выбрали 5 и записали их в файл с адресами последовательностей.

- затем командой (seqret @myproteins.list myproteins.fasta) получили эти последовательности в fasta-формате.

b. Построение множественного выравнивания моего белка и всех найденных гомологов.

- открыв выравнивание в JalView, через меню File загрузили файл с последовательностями в fasta-формате

- затем через меню "Web Service - Alignment" построили выравнивания с помощью разных программ (Clustal и TCoffee)

- построив выравнивания, раскрасили их с помощью ClustalX - одной из схем раскраски аминокислотных остатков.

↓
→ выравнивание с помощью Clustal

↓
→ выравнивание с помощью программы TCoffee

c. Описание структуры выравнивания.

Для того, чтобы лучше разобраться в выравнивании и "прочувствовать" участки с разной долей консервативных позиций, было сделано несколько раскрасок выравнивания в зависимости от порога консервативности (100, 40 и 20):

-> порог=100

-> порог=40

-> порог=20

Теперь для последнего случая выделим блоки с повышенной долей консервативных позиций, в этом нам помогла разметка Conservation, а также интенсивность окраски в самом выравнивании:

Координаты по столбцам выравнивания	Координаты по остаткам моего белка	Скрин-шоты
9 - 15	1 - 7
25 - 30	17 - 22
37 - 45	29 - 37
63 - 74	55 - 66

К описанию выравнивания добавим филогенетическое дерево (процент идентичности, среднее расстояние), где данные не противоречат таксономическому положению организмов:

Также можно утверждать, что на участках 1-7 и 75-334 выравнивание не имеет биологического смысла. Во втором случае выделяем такой большой участок из-за того что среди выбранных нами белков - 4 имеют длину последовательности до 75 аминокислотных остатков, а у 2-х белков длина составляет уже 335 а.о. Как раз на картинке мы видим как, начиная с 75-ого столбца, выравниваются только два длинных белка.

- - -

Так что для этих двух белков выравнивание безусловно несёт в себе биологический смысл, но во множественном выравнивании с другими белками мы этот продолжительный участок не рассматриваем.

d. Указание групп сходных аминокислот, которые образуют в моем выравнивании функционально консервативные позиции.

Функционально консервативные позиции в выравнивании образуют следующие группы сходных аминокислот (в скобках указано число таких групп в выравнивании):

LIV - [5]
LI - [8]
IV - [4]
KE - [4]

Можно, конечно, привести ещё примеры таких групп, но мы выбрали самые явные и часто встречающиеся.

2. Программа Muscle.

Чтобы получить последовательности малых дельта-антигенов из банка Swiss-Prot, мы воспользовались SRS. Все дельта-антигены происходят из вирусов рода "Deltavirus" и имеют в описании слово "delta"; малые дельта-антигены в описании имеют ещё слово "small". Поэтому в SRS создаём запрос к банку Swiss-Prot, написав:

17 найденных последовательностей сохранили в fasta-формате.

Далее открываем этот файл в JalView. После чего с помощью программы muscle выравниваем невыровненные последовательности, выполняя команду (muscle -in delta.fasta -out delta_aligned.fasta). На выходе получаем файл с выровненными последовательностями в fasta-формате.

То же выравнивание можно было получить и с помощью muscle в JalView. Отличие лишь в том, что последовательности остаются в заданном порядке (при параметрах по умолчанию), а в первом случае - они выдавались по увеличению длины последовательностей.

Используя JalView, раскрашиваем выравнивание по BLOSSUM62 с порогом 30.

Как мы видим консервативных участков достаточно много.
Имеются идентичные с большой протяженностью: 50-54, 70-73, 102-112, 126-131, 161-170, 174-180 (координаты для выравнивания).
А в качестве функционально консервативных можно выделить: KK, RK, GG, LS и т.д.

Выравнивание сохранили в формате msf, а также в формате jar (так как он позволяет сохранять выравнивания с дополнительной информацией, например окраской)