Отчет по работе над зачетным заданием.

1. Определение возможных генов в сегменте генома Klebsiella pneumoniae на основании близко родственного аннотированного генома Escherichia coli K-12.

Для пробного аннотирования возможных генов в сегменте на основании генома E.Coli, я произвел следующие действия:

скачал в папку Credit1 файл с сегментом в 10000 н.о. из генома Klebsiella pneumoniae.
Используя команду
seqret sw:*_ECOLI
вытащил из банка SwissProt полный протеом бактерии E.Coli (сохранен в файле proteom.fasta).
Создал индексные файлы для протеома E.Coli с помощью команды:
formatdb -i proteom.fasta -p T -n pc
Получил последовательности открытых рамок в заданном сегменте с помощью программы
getorf -minsize 240 -table 11 -find 1
(сохранены в файле orf.fasta) Всего найдено 33 возможных открытых рамок считывания.
Создал скрипт-файл (script.chmod), одну из 33 строчек (количество определенных ORF'ов в сегменте) привожу здесь:
seqret orf.fasta:KPN2Jun2003_1 stdout | blastall -p blastp -d pc -e 0.001 | grep -c Identities
Этот конвейер позволяет:
- Вытащить из файла orf.fasta определенную своим номером, открытую рамку считывания (обобщенное имя: KPN2Jun2003_№),
- произвести локальное выравнивание этой белковой последовательности по протеому E.Coli и
- подсчитать число выравниваний с e-value лучше, чем 0.001

Обоснование выбора программы и типа данных, по которым велся поиск. Задача упражнения - найти с высокой степенью достоверности (e-value < 0.001) возможные гомологичные гены в составе сегмента для генов E.Coli, дабы фактически картировать этот участок генома Klebsiella pneumoniae, на наличие генов определенных белков, родственных соответствующим белкам E.coli. Так как мы имеем дело с кодирующими последовательностями, то использовать программы, непосредственно использующие ДНК-последовательности для парного выравнивания (типа BlastN), не целесообразно из-за вырожденности генетического кода (третья позиция в кодоне сильно вариабельна). Также в алгоритме BlastN используется очень длинный якорь (в 11 нуклеотидов), отчего всегда есть высокая вероятность "зацепить что-то лишнее и пропустить что-то важное". Поэтому для повышения специфичности поиска, необходимо вести идентификацию возможных генов в сегменте, выравнивая белковые последовательности транскриптов кодирующего генома E.coli с предсказанными ORF'ами в заданном сегменте генома Klebsiella pneumoniae. Тогда здесь возможны два варианта работы:

Получаем полный протеом E.coli (см. действие 1) - готовая база данных, которую лишь необходимо перевести в доступный вид для программы BLASTALL (см. дествие 2). Затем ищем возможные ORF'ы, автоматически транслируемые в белковую последовательность (см. выше действие 3), и используя конвейер программ, прогоняем каждый ORF по нашей базе данных (протеом E.Coli), получая возможные выравнивания.
Другой вариант - используем полный геном E.coli в качестве базы данных (словаря) для программы TBLASTN, и прогоняем каждый ORF в поисках возможных гомологов. Но нужно учесть, что в алгоритме TBlastN весь геном E.coli будет оттранслирован в шести!! рамках и каждый из этих белковых транслятов будет выравнен с каждым ORF'ом (которых также немало). Очевидно, время поиска будет значительно дольше и не факт, что специфичнее, чем первый способ. Скорее даже наоборот. Впрочем, когда геном кишечной палочки давно полностью (или почти?) аннотирован, почему бы не воспользоваться накопленными человечеством знаниями ввиде протеома E.Coli?? Тогда и время выполнения задания сократится и все будет хорошо!!... .

По приведенным выше причинам, для выполнения поиска был выбран первый путь, в результате чего были получены некоторые результаты, которые представляют собой модель генетического строения участка ДНК из генома Klebsiella pneumoniae. Всего было сделано для 5-ти ORF'ов адекватные выравнивания с e-value<0.001, и только для одного из них получены выравнивания с шестью генами (в остальных случаях - выравнивания с одиночными генами E.coli, впрочем результаты подсчета представлены здесь, если интересно посмотреть на выравнивания - можно заглянуть сюда). Для ORF'а, который оказался выравненный с шестью генами, я выбрал в качастве возможного названия гомологичного гена в составе K.pneumoniae имя гена E.coli с наилучшим e-value в выравнивании, но учитывая, что почти все (пять из шести генов) кодируют один и тот же белок по функции - оксидоредуктазу, то особо сомневаться на счет значимой гомологии не пришлось.

Гипотетические гены во фрагменте 3869583-3879583, по данным выравнивания и без доработок:

Начало:

3'----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5'

5'--[=>ген sfsB, 6345-6650]--[=>ген srlA, (gutA) 6766-7284][=>ген srlB, (gutB) 7284-7655][=>ген srlE, (gutE) 7655-8632]-3'

Продолжение:

3'--------------------------5'
                            
5'-[=>ген ycjS, 8643-9185]--3'

Где соответствующий ген кодирует следующие белки:

активатор катаболизма сахаров B, а в составе протеома E.Coli еще известен как ДНК-связывающий активатор транскрипции оперона метаболизма мальтозы [возможно это и есть тот самый белок БАК - белок-активатор катаболитных оперонов!!!] (Sugar fermentation stimulation protein B [Ner-like protein, DNA-binding transcriptional activator of maltose metabolism]) - кодируется геном sfsB, nlp
сорбитол пермеаза IIC компонент (Glucitol/sorbitol permease IIC component) - кодируется геном srlA, gutA
сорбитол-специфичная фосфотрансфераза, IIA компонент (Glucitol/sorbitol-specific phosphotransferase enzyme IIA component) - кодируется геном srlB, gutB
сорбитол-специфичная фосфотрансфераза, IIВ компонент (Glucitol/sorbitol-specific phosphotransferase enzyme IIB component) - кодируется геном srlE, gutE
гипотетическая оксидоредуктаза (Hypothetical oxidoreductase) ycjS - кодируется геном - ycjS

Анализируя данное строение сегмента, хочется сказать следующее: в участке генома Klebsiella pneumoniae 3869583..3879583 локализован оперон, кодирующий гены для катаболизма углеводов: в данном случае сорбитола. Причем на этом же участке, в непосредственной близости от оперона, расположен ген "активатора катаболитных оперонов": белок - активатор катаболизма сахаров B, который, связываясь в области промотора данного оперона, способствует РНК-полимеразе транскрибировать гены белков целого метаболитического пути: распад сорбитола. С учетом огромного накопленного практического материала, можно предложить следующий сценарий активности оперона: повышение концентрации в клетке сорбитола (или просто появление субстрата в клетке) запускает цепную реакцию клеточного ответа: очевидно, он будет опосредован Gs-рецепторным комплексом, приводящим в действие aденилатциклазу, что приводит к повышению концентрации в клетке cAMP - важного вторичного мессенджера во многих метаболитических процессах. Также эта молекула выполняет роль кофактора в работе БАК: без cAMP этот белок не активен (в моем случае роль этого белка может выполнять продукт гена sfsB). Тогда активированный белок способствует связыванию РНК-полимеразы с опероном, как полагают, за счет повышения константы связывания РНК-полимеразы к промотору и быстрому переводу комплекса [РНК-полимераза<->ДНК] в открытое состояние, что приводит к транскрипции белков, ответственных за распад "топлива" - углеводов (в моем случае - сорбитол). Репрессия оперона может иметь самые разные сценарии, но можно предположить, следующее: когда в клетке нет сорбитола, то в области промотора с опероном связан белок-репрессор, подавляющий его транскрипцию, но с появлением молекул субстрата происходит связывание одной (или нескольких) с репрессором, что переводит его в иное конформационное состояние, которое уже не способно связываться с ДНК - следовательно, белок-репрессор отваливается от промотора, и уже ничто не мешает РНК-полимеразе транскрибировать оперон. Так этот тип организации сегмента и модель возможной активности оперона представлены следующим образом:

Идентификация положения генов у E.coli изучалась на полном геноме бактерии. В геноме E.Coli расположение возможных гомологов несколько отлично, а оперон катаболизма сорбитола/глюкозитола содержит куда больше генов, хотя все гены также расположены на смысловой ДНК (не на комплементарной):

Начало:

3'-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------3'

5'--[=>ген ycjS, 1374856-1375911]--------[=>ген srlA, (gutA) 2823854-2824417][=>ген srlЕ, (gutE) 2824414-2825373]-[=>ген srlB, (gutB) 2825384-2825755]-5'


Продолжение:

3'--------------------------------------------------------------------------------------------------------------5'
                                                                                                              
5'-[=>ген srlD, (gutD) 2825759-2826538]---[=>ген gutM 2826643-2827002]---------[=>ген sfsB 3332931-3333209]-----3'

Сравнивая строение соотносимых участков генома E.Coli и Klebsiella pneumoniae можно отметить следующее:

Содержание генов в сорбитольном/глюкозитольном опероне у E.Coli и K.Pneumoniae различно: у первой бактерии 5 генов, а у второй - всего три (считая, что в оперон входят гены с синонимичным названием gutX, (X=A, B, D, E, M)). Причем внутри оперона порядок генов также различен. Итак у E.Coli общий вид оперона: gutA-gutE-gutB-gutD-gutM, у K.Pneumoniae: gutA-gutB-gutE. Видно, что, возможно, в процессе эволюции от общего предка у K.Pneumoniae из оперона выпало два последних гена, присутствующих в опероне у E.Coli, и также произошла реверсия участка gutE-gutB. Объяснений этому можно найти много, приведу лишь то, что приходит сразу же в голову: Аннотация генов gutD, gutM в составе генома E.Coli говорит о следующем: gutD кодирует сорбитол-6-фосфат дегидрогеназу, gutM - ДНК-связывающий активатор транскрипции глюкозитольного оперона (типа специфичный активатор, аналог sfsB, который возможно менее специфичен). Почему же этих двух генов нет в составе оперона K.Pneumoniae? Ha карте генов сегмента K.Pneumoniae видно, что поблизости с опероном расположен ген sfsB (кодирующий БАК) - всего на расстоянии 116 н.о. Тогда как у E.Coli ген sfsB расположен за 500000 н.о. - очень далеко. Но фактически его функцию (активация оперона) выполняет его аналог - ген gutM, который находится очень рядом - фактически в составе этого оперона. Видимо в процессе эволюции бактерии K.pneumoniae рядом с опероном соседствовали ген gutM и sfsB, но из-за аналогичности, взаимозаменяемости функции, один из них был неактивен (избыточная продукция оперона также вредна, как и её недостаточность). Поэтому произошло выпадение гена gutM из состава оперона. GutD - сорбитол-6-фосфат дегидрогеназа - мог выпасть из оперона, например, из-за редукции метаболитической стадии, обеспечиваемой данным ферментом. Я считаю, что произошел именно процесс редукции: действительно, E.Coli - сапротроф, фактически сапротрофия - первичный тип приспособления к обитанию, тип питания, по сравнению с паразитизмом (все же многоклеточные появились намного позже, чем одноклеточные стали заселять Землю). И E.coli содержит все гены в опероне, необходимые для усвоения углевода. А K.pneumoniae - сапротроф/паразит, вызывает легочные болезни. Возможно, находясь в клетке хозяина, бактерия может использовать не сам субстрат (сорбитол), а продукт первичной обработки ферментами хозяина. Действительно, дегидрогеназы - одни из первых, в стадиях метаболизма, системы окисления сахаров. Поэтому и нет гена дегидрогеназы gutD в составе оперона у K.pneumoniae - бактерии он просто не нужен (чтобы не тратить лишнюю энергию на производство избыточных систем обработки субстрата), ей достаточно забрать продукт окисления углеводов дегидрогеназными системами клетки-хозяина.
Относительное расположение генов в двух геномах различно: в составе K.Pneumoniae все находки довольно плотно легли в участок 2900 н.о., тогда как у E.coli гомологичные гены распылены на сегменте в 1958353 н.о. О чем это свидетельствует? Да, вообщем то ни о чем, если подходить к вопросу серьезно :). Но можно сказать, что сильное родство двух организмов ещё не есть абсолютный фактор сходственного строения генома, правда для малой выборки генов (всего 5-ть штук), и наоброт.
Наличие сорбитольного/глюкозитольного оперона в геноме обеих бактерий говорит о важности данного углевода в метаболитическом обмене организма.
Разное содержание генов в оперонах бактерий, их структурное разнообразие (реверсии и т.п.) позволяет судить о динамичности данного оперона в эволюционном процессе, об адаптационной изменчивости композиции генов в зависимости от способа питания, места обитания и др.