Занятие 8. Программа BLASTP.

Задание №1.

Поиск белка по его последовательности.

На сервере NCBI был проведён поиск последовательности моего белка ARGB_ECOLI программой BLASTP в банке swissprot. В выдаче программы найден мой белок и в таблице занесены ответы на вопросы, поставленные в задании:
Порядковый номер в выдаче: первый Score = 459 bits E-value = 4e-129
Поиск последовательностей по pdb-идентификатору.

Повторен поиск с той же входной последовательностью, но теперь указан в качестве банка pdb. Ответы на вопросы также оформлены ввиде таблицы:


PDB-коды: 1OHB,1OHA, 1OH9, 1GSS
Идентификаторы цепей: все идентификаторы оказались одинаковыми - CHAIN A.
Score: 441 bits
E-value: 3e-130
Начало и конец выравнивания у входной последовательности (Query) и у находки (Subject): 
выравнивание последовательностей охватывает участки с первой до последней аминокислот.
Процент совпадений (Identity): 100%

Комментарии:

Для облегчения понимания, я решил оформить комментарии увиденных результатов поиска в банках Swissprot и pdb по принципу сравнения:

Очень удобный интерфейс!! Вся необходимая информация как на ладони: имена, AC возможных гомологов, представлены списком, напротив каждого из них указан вес соответствующего выравнивания в битах (между этим "гомологом" и последовательность Query), который причем является ссылкой на выравнивание (очень удобно!!); также рядом со значением веса указано e-value; есть ссылка Taxonomy reports, позволяющая узнать таксономическую принадлежность организмов, в которых найдены данные гомологи, а также таксономию организма, которому принадлежит последовательность Query; анализируя выравнивания, можно отметить, что указаны все необходимые его характеристики: длина (Lenght), вес (в битах, а рядом в скобках - вес ненормированный), e-value, процент идентичности (Identity), процент сходства (Positives), процент гэпов (Gaps); у самого выравнивания указаны начало и конец (как для последовательности Query, так и для последовательности Subject), консенсусная последовательность. (Я полагаю, что эти свойства NCBI BLAST очень важны, так как удобство представления результатов поиска облегчает их интерпретирование ♥)
Бросается в глаза размер соответствующих баз данных (BD): Swissprot по количеству содержащихся аминокислотных последовательностей (195650) значительно превышает PDB (24804). (Но эти данные приведены на 31 марта 2006г.: так как размеры DB постоянно изменяются, то приводимые данные нельзя принимать наверу: но в принципе, количество установленных структур всегда меньше, чем установленных последовательностей хотя бы по тому, что процесс расшифровки намного сложнее, чем идентификация последовательности полимера).
Количество найденных сходных последовательностей также различно: в Swissprot'e найдено 164 возможных гомологов, в PDB их значительно меньше: всего 11.
Результат поиска в Swissprot'е содержит последовательности белков с диапазоном e-value от 4е-129 (у моей последовательности) до 7е-16, причем при заданном пороге e-value=10, а в PDB разброс e-value составил от 3е-130 до 9,5. Ясно, что результатам Swissprot'a на наличие возможных гомологов можно доверять в большей степени, чем результатам PDB-банка (последовательности с e-value>1 стоит проверить вручную: вполне возможно, что среди них есть как гомологи: например, с консервативным активным центром, так и случайные последовательности).
В результатах поиска в Swissprot'e есть ссылки на Gene info - аннотацию гена, кодирующего данный белок, а в результатах поиска в PDB приведены ссылки на структуры (Related structures) найденных возможных гомологов, что намного облегчает доступ к необходимой информации.
Посмотрим на полученную информацию, содержащуюся в таблицах выше. Как можно заметить, величины Score и e-value в обеих таблицах очень похожи: 459; 4е-129 из результатов поиска в Swissprot'e и 441; 7е-125 - в pdb соответственно. Очевидно такие прекрасные результаты обусловлены тем, что последовательность ARGB_ECOLI, введенная в запрос программы BLASTP, нашла "саму себя": поэтому также и 100% совпадений.

Задание №2. Поиск белка по его гомологу.

Ввожу в поле поиска последовательность ARGB_ACIAD.fasta (соответствующая последовательности Secondprot.fasta). Эта последовательность из протеома Acinetobacter, найденная программой SRS на сервере EBI, вероятно является гомологом ARGB_ECOLI. Анализ на наличие последовательности моего белка в результатах поиска приведен в таблице:


Порядковый номер последовательности ARGB_ECOLI - 111 (включая QUERY: последовательность ARGB_ACIAD)
Score = 115 bits
E-value = 2e-25
Начало и конец выравнивания во входной последовательности (Query) и в находке (ARGB_ECOLI):   (*)
у входной последовательности ARGB_ACIAD выравнивание начинается с 29 аминокислоты, кончается на 262-ой.
В найденной последовательности ARGB_ECOLI выравнивание начинается с 5-ой аминокислоты, завершается 226-ой. 
Процент совпадений: 31% (*)

(*) произошла некоторым образом детективная история: результат программы BLASTP оказался очень большим и все выравнивания с e-value выше 5е-67 просто не отобразились на экране. Поэтому пришлось пойти на хитрость: в строке параметров "Limit results by entrez query or select from:" выбрал Escherihia Coli, чтобы в числе находок были белки только из EColi. Так удалось заполучить недостающие данные.
В задании также спрашивается: "Является ли первая по счету находка тем самым белком, чья последовательность была подана на вход?" С уверенностью можно сказать, что последовательность, введенная в поиск: ARGB_ACIAD - является первой в строке поиска BLASTP.

Задание №3. Поиск белка по фрагментам его последовательности

Проведен поиск в банке swissprot программой BLASTP белков, возможно чем-то похожих на последовательность из файла thirdprot.fasta, которая была подана в окно поиска. В таблице также занесены ответы на вопросы, которые были заданы в предыдущем задании:


Порядковый номер последовательности ARGB_ECOLI - 3 
Score = 35.8 bits
E-value = 0,026
Начало и конец выравнивания во входной последовательности (Query) и в находке (ARGB_ECOLI): 
Выравнивание последовательности из файла Thirdprot.fasta полностью совпало с участками из белка ARGB_ECOLI,
которые были взяты для создания этого пептида: выравнивание начинается с первых аминокислот обоих белков, 
и заканчивается: у пептида Thirdprot на 21-ой аминокислоте, у белка ARGB_ECOLI - на 39-ой аминокислоте.
Процент совпадений: 53%

Выводы:

Программа BLASTP обнаружила всего 6 белков, содержащих в своей последовательности сходные участки с пептидом из файла Thirdprot.fasta, причем с очень низким весом выравнивания: для всех выравниваний величина Score меньше 40.
Очевидно, что такой малое количество возможных гомологов можно объяснить тем, что порог для e-value был установлен по умолчанию равным 10. Соответственно с определением e-value были получены результаты, которые можно интерпретировать так: если у выравнивания e-value>>1, то есть некоторая доля вероятности, что это выравнивание найдено по случайным причинам. Причем, чем длиннее последовательность Query, тем больше шансов найти выравнивание с е-value намного меньше единицы. Но так как пептид Thirdprot состоит из всего 21 аминокислоты, то вероятность найти выравнивание с каким-либо белком по случайным причинам сильно увеличивается. Поэтому, если установить порог для e-value больше 10, то можно получить куда больше выравниваний, но которым, к сожалению, доверять без проверки не стоит.
Действительно, установив порог для e-value на 100 удалось получить семь выравниваний, причем для последего e-value = 77!!

Задание №4. Разные пользовательские интерфейсы BLAST

Я повторно выполнил предыдущее задание (поиск белка по фрагментам его последовательности) на сервере EBI и на сервере Пастеровского института.
Программа BLAST на сервере EBI выдала результаты поиска в Swissprot'e, ничем не отличимые от результатов программы BLASTP на сервере NCBI, но способ представления этих результатов намного отличается от NCBI: во-первых, результаты появляются в том же окне, что и запрос, а это очень неудобно, когда приходится делать несколько выравниваний параллельно; во-вторых, выравнивания запрашиваемого пептида с возможными гомологами не представлены в одном окне результатов, как это есть на сервере NCBI (хоть это отличие двух серверов не очень значительно, но все же наличие необходимой информации в простом и понятном формате, на одной странице и прекрасно организованной, как это есть на сервере NCBI, значительно упрощает жизнь ученому!!). Но все же есть и свои плюсы: результаты собраны в одной таблице, в которой указаны номер гомолога в выдаче, его ID, синонимичные названия, длина последовательности возможного гомолога, вес локального выравнивания, проценты идентичности и сходства, e-value; ID каждой последовательности является ссылкой на swissprot'овское описание (причем очень красиво оформленное!!); на самом верху листа результатов указаны параметры построения локального выравнивания: Database, в которой проводился поиск, тип биологического текста (белковая или нуклеотидная последовательность), программа выравнивания, её версия, матрица аминокислотных замен, штрафы за открытие и продолжение гэпов. А ещё представлены различные ссылки:

"Show annotation" - показывает аннотации каждого возможного гомолога единым списком.
"Show alignments" - показывает все выравнивания, представленные, как на сервере NCBI. .
"MView" - представление выравниваний списком и цветное изображение букв аминокислот (видимо окраска соответствует классификации аминокислот по физико-химическим свойствам).
и многое другое...

Программа BLAST на сервере Пастеровского института выдала результаты поиска в Swissprot'e несколько отличные от результатов на сервере NCBI: было найдено девять последовательностей, а не шесть. Но это можно объяснить тем, что в результатах фигурируют разные штаммы ECOLI, отчего количество выравниваний повысилось. Но в целом, сервер неплохой, хотя не без изъянов. При составлении запроса требуется обязательно ввеcти свой email, иначе программа не заработает: причем результаты выравнивания отправляются либо по почте, либо доступны интерактивно; также результаты представляются в том же окне, где вводился запрос на поиск; возможный минус: нужно пройти несколько ссылок на различные страницы, прежде чем выйдете на страницу результатов; но в целом интерфейс вывода результатов похож на интерфейс, реализуемый на сервере NCBI.

Задание №5. Является ли BLAST инструментом для поиска ортологов?

Предлагаю подойти к решению данной проблемы с формальной стороны. По определению, ортологи - последовательности, произошедшие в результате видообразования из одной последовательности и расположенные в разных организмах. Причем ортологи как правило ответственны за одну и ту же функцию. Для выяснения данного вопроса необходимая последовательность белка RBSR_BACSU была взята с сервера ExPASy.org и затем использована для поиска возможных гомологов программой BLASTP. В результате, программа нашла 90 различных последовательностей с довольно хорошими e-value: от 3е-67 до 7,8. Как сказано в задании:"В первом приближении будем считать ортологами те последовательности, в названии которых стоит слово RbsR", то можно заметить, что в списке найденных последовательностей есть следующие белки:


RBSR_BACHD, e-value=3e-67 
RBSR_LACLA, e-value=2e-63
RBSR_PASMU, e-value=1e-33
RBSR_HAEIN, e-value=6e-30
RBSR_SHIFL, e-value=5e-29

В описании всех этих белков сказано, что они выполняют одну функцию: репрессия рибозного оперона; все эти белки найдены в разных организмах, о чем свидетельствует ID этих белков и краткое описание. Также, посмотрев на выравнивания последовательностей этих белков с RBSR_BACSU и используя знания о консервативном домене, присутствующем в последовательности RBSR_BACSU, я заметил, что тот же функциональный домен есть и в найденных белках. Ясно, что эти данные свидетельствуют о том, что белки являются ортологами (опираясь на выше изложенное определение). Но не стоит забывать о том, что эти пять белков были найдены в выборке размером в девяносто белков! Причем среди них есть как белки из того же организма, что и RBSR_BACSU (значит, это потенциальные паралоги), так и репрессоры других углеводных оперонов. Поэтому напрашивается вывод: BLASTP нашел возможные гомологи, но при этом без дифференциации на ортологов или парологов. Таким образом, BLASTP вполне может использоваться как инструмент для поиска гомологов, среди которых можно идентифицировать ортологи, зная дополнительно их признаки.