На главную страницу четвертого семестра.

Занятие 1. Биоинформатика и эволюция.

Задание №1. Сравнение разных способов оценки эволюционных расстояний между 2-мя генами.

Для достижения поставленной цели, были сделаны следующие операции:

Из начальных данных предыдущего практикума за третий семестр (занятие "Банк EMBL), взята последовательность гена моего белка ARGB_ECOL:

>gene argB E.coli
atgatgaatccattaattatcaaactgggcggcgtactgctggatagtgaagaggcgctg
gaacgtctgtttagcgcactggtgaattatcgtgagtcacatcagcgtccgctggtgatt
gtgcacggcggcggttgcgtggtggatgagctgatgaaagggctgaatctgccggtgaaa
aagaaaaacggcctgcgggtgacgcctgctgatcagatagacattatcaccggagcactg
gcgggaacggcaaataaaaccctgttggcatgggcgaagaaacatcagattgcggccgta
ggtttgtttctcggtgacggcgacagcgtcaaagtgacccagcttgatgaagagttaggt
catgttggactggcgcagccaggttcgcctaagcttatcaactccttgctggagaacggt
tatctgccggtggtcagctccattggcgtaacagacgaagggcaactgatgaacgtcaat
gccgaccaggcggcaacggcgctggcggcaacgctgggcgcggatctgattttgctctcc
gacgtcagcggcattctcgacggcaaagggcaacgcattgccgaaatgaccgccgcgaaa
gcagaacaactgattgagcagggcattattactgacggcatgatagtgaaagtgaacgcg
gcgctggatgcggcccgcacgctgggccgtccggtagatatcgcctcctggcgtcatgcg
gagcagcttccggcactgtttaacggtatgccgatgggtacgcggattttagcttaa

создана гипотетическая модель эволюции гена моего белка ARGB_ECOLi:

Допущения: на каждом этапе эволюции происходят замены, причем число замен на последовательных этапах равно:

  этап эволюции     "истинные" расстояния (число замен на 100 нуклеотидов)  общее число замен (длина гена argB = 777 п.н.)  

gene argB__Mutant1                       10                                                   ~78
Mutant1__Mutant2                         10                                                   ~78
Mutant2__Mutant3                         30                                                   ~233
Mutant3__Mutant4                         25                                                   ~194
Mutant4__Mutant5                         50                                                   ~389 
Mutant5__Mutant6                         50                                                   ~389

Данную таблицу удобнее преобразовать следующим образом:

gene argB    0        10       20       50       75       125      175 
Mutant1               0        10       40       65       115      165       
Mutant2                        0        30       55       105      155  
Mutant3                                 0        25       75       125 
Mutant4                                          0        50       100 
Mutant5                                                   0        50 
Mutant6                                                            0
         gene argB Mutant1  Mutant2  Mutant3  Mutant4  Mutant5  Mutant6

В каждой ячейке данной таблицы стоят "истинные" попарные расстояния между последовательностями гена и мутантами. Причем расстояния между "дальними" мутантами - между ними произошло не менее 2-х эволюционных событий - можно рассчитать по следующей формуле (также если приписать исходному гену название "Mutant0":
N_ij = ∑N_k-1,k
где N_ij - эволюционное расстояние между генами i и j; суммирование в пределах от i+1 до j.

Теперь необходимо получить мутантные последовательности. Это осуществлялось с помощью программы msbar пакета EMBOSS, из командной строки Unix. При этом использовалась следующая команда (приведен пример для первого этапа gene__mutant1):
msbar argB.fasta m1.fasta -point 4 -count 84 -auto
данная строка расшифровывается так: последовательность argB.fasta изменяется случайным образом в последовательность m1.fasta посредством введения 84 замен (count 4).

Вообще, был написан скрипт my.script для получения последовательностей всех мутантов в одном файле argB.fasta. Он выглядит следующим образом:

msbar argb.fasta m1.fasta -point 4 -count 78 -auto; msbar m1.fasta m2.fasta -point 4 -count 78 -auto; msbar m2.fasta m3.fasta -point 4 -count 233 -auto; msbar m3.fasta m4.fasta -point 4 -count 194 -auto; msbar m4.fasta m5.fasta -point 4 -count 389 -auto; msbar m5.fasta m6.fasta -point 4 -count 389 -auto; cat m1.fasta >> argb.fasta; cat m2.fasta >> argb.fasta; cat m3.fasta >> argb.fasta; cat m4.fasta >> argb.fasta; cat m5.fasta >> argb.fasta; cat m6.fasta >> argb.fasta

Чтобы исполнить его, использовались команды:
chmod +x my.script
./my.script

Наконец, необходимо было получить результаты использования программы distmat, подсчитывающей эволюционные расстояния, но при разных реализуемых алгоритмах: один алгоритм, строящий матрицу неоткорректированных эволюционных расстояний (попарные различия!!, D), а другой алгоритм - использующий формулу Джукса-Кантора (JC).
Для этого, в строке Unix вводилась следующая команда:
distmat -sequence argB.fasta -outfile D.distmat -nucmethod 0 - в файле D.distmat представлена матрица попарных различий.
distmat -sequence argB.fasta -outfile JC.distmat -nucmethod 1 - в файле JC.distmat представлена матрица попарных расстояний, вычисленных по алгоритму Джукса-Кантора.
Итак, имеем три матрицы эволюционных расстояний: матрица "истинных" попарных расстояний (T), матрица попарных различий (D), матрица попарных расстояний , вычисленная по алгоритму Джукса-Кантора (JC).
Для их представления в более читабельном виде и сравнения создана книга Exel - evol, в которой на странице All_data представлены все три матрицы, а на странице Comparison они подвергнуты сравнению. В результате сравнения получен следующий график (который, правда несколько оптимизирован и увеличен, поэтому представлен в книге на странице GRAPH):

Рис.2. График оценок и истинных расстояний.

На рисунке красной пунктирной линией показаны величины "истинных" эволюционных попарных расстояний, синей сплошной - величины попарных различий, розовой сплошной - величины попарных расстояний, вычисленных по алгоритму Джукса-Кантора. В подписях к оси X кроме значения "истинных" расстояний, также приведены обозначения сравниваемых попарно последовательностей: g - значит последовательность гена argB; mX - последовательность мутанта mX. Тогда обозначение "mXmY - попарное сравнение последовательностей мутанта mX с мутантом mY.
Итак, для "истинных" расстояний учитывается каждая нуклеотидная мутация. Таким образом, график зависимости числа замен от истинных замен представляет собой прямую пропорциональность. При малом числе мутаций, что приблизительно составляет 15 нуклеотидных замен на 100 нуклеотидов, все три графика (прямая истинных расстояний (T), оценки по Джуксу-Кантору (JC) и графика попарных различий (D)) практически идентичны. А вот дальше отличия проявляются и весьма заметные.
Кривая попарных различий расположена ниже графика "истинных расстояний". При этом видно, что она постепенно стремится к горизонтальной прямой - ассимптоте: возможно, приблизительно, эта прямая составляет 70-80 нуклеотидных замен на 100 нуклеотидов., так как кривая, впринципе, пересекает значение в 60 нуклеотидных замен на 100 нуклеотидов последовательности и далее некоторым образом растет, но очевидно (так как производная графика довольно мала [так "на глазок"]) она приближается к определенной горизонтальной ассимптоте. Видимо, это связано с инструментальной ошибкой метода оценивания, так как при данном способе оценки не учитываются возможные обратные замены, отчего при большом числе замен, общее количесто различных замен уменьшается, и относительный "рост" графика замедляется: он выходит на плато.
Также, таким метод сравнения двух последовательностей не учитываются последовательные различные мутации в одном кодоне, то есть, например, процесс изменения ТТТ в исходной последовательности >> ТТС в промежуточной последовательности >> ТТА в результарующей последовательности приводят к идентификации одного различия начального и конечного кодонов, в то время как произошло 2 мутации. Кривая, построенная на основании данных расчета по алгоритму Джукс – Кантора (модель предполагает равные вероятности замен между всеми четырьмя типами нуклеотидов с вероятностью р = a), также лежит несколько ниже графика "истинных расстояний", но выше кривой для попарных различий на 100 нуклеотидов. Можно отметить, что при числе истинных замен, равном 175, число замен, рассчитанных по методу Джукса-Кантора, составляет около 142, то есть расчетная величина отличается от реальной на: (175 - 142)/175 * 100% = 18,9%, тогда как расчетная величина, полученная от использования метода попарных различий, отличается от реальной на целых (175 - 64)/175 * 100% = 63,4%!!!. Фактически, метод оценки эволюционных расстояний по алгоритму Джукса-Кантора эффуктивнее на целых 44,5%!!, чем алгоритм оцеки эволюционных расстояний по методу попарных различий.
Очевидно, это связано с тем, что алгоритм Джукса-Кантора учитывает вероятность возможных обратных замен, тогда как метод оценки попарных различий совершенно не способен к такому учету.

Задание №2. Описание элементарных эволюционных событий для случая 3-х замен в одном кодоне.

Заданны следующие исходный и конечный кодоны:

TGT - цистеиновый кодон Cys.
CGA - аргининовый кодон Arg.

Посмотрев внимательно на данные кодоны,можно заметить, что минимальным путем эволюции исходного кодона в конечный, будет путь, состоящий из двух замен, а не трех, так как второе нуклеотидное основание одинаково в обоих кодонах: G.
Итак, пути эволюции выглядят следующим образом:

На схеме использованы следующие обозначения:

S1 - число потенциальных синонимичных сайтов в кодоне TGT.
N1 - число потенциальных несинонимичных сайтов в кодоне TGT.
S2 - число потенциальных синонимичных сайтов в кодоне CGT.
N2 - число потенциальных несинонимичных сайтов в кодоне CGT.
s - число синонимичных замен.
n - число несинонимичных замен.
светло-зеленая стрелка - разрешенные эволюционные пути.
красная стрелка - не разрешенные эволюционные пути (проходят через стоп-кодон).
нуклеотидное основание, выделенное серым цветом - замена.

Расчет данных схемы, а также скоростей синонимичных и несинонимичных замен (Ks и Ka соответственно), приведен ниже:

число потенциальных синонимичных сайтов для кодона TGT вычислялось так: замена по первому нуклеотиду кодона приводят к несинонимичной замене; замена по второму кодону - также к несинонимичной замене; из трех доступных замен по третьему нуклеотиду, одна замена: T -> A приводит к нонсенс-кодону, следовательно эту замену в расчетах не учитываем (полагая, что эволюция через стоп-кодоны не возможна). Так что для третьего нуклеотида возможны только две замены, из них одна - синонимичная (T -> C: приводит к кодону TGC). Так что S = 0 + 0 +0,5 = 0,5.
число потенциальных несинонимичных сайтов для кодона TGT вычислялось по формуле: N = 3 - S. Так что N = 3 - 0,5 = 2,5.
число потенциальных синонимичных сайтов для промежуточного кодона CGT вычислялось так: замена по первому нуклеотиду кодона приводят к несинонимичной замене; замена по второму кодону - также к несинонимичной замене; любая замена по третьему кодону - к синонимичной замене. Так что для третьего нуклеотида возможны все три замены, и S = 1 + 0 + 0 = 1.
число потенциальных несинонимичных сайтов для промежуточного кодона CGT равно N = 3 - 1 = 2.
число наблюдаемых синонимичных замен за эволюционный путь равно: s = 1, что наблюдается в замене CGT -> CGA.
число наблюдаемых несинонимичных замен за эволюционный путь равно: n = 1, что наблюдается в замене TGT -> CGT.

рассчитаем Ks - число синонимичных замен на 1 синонимичный сайт. Но сперва произведем подготовительные операции. Из схемы видно, что есть два потенциальных пути эволюции от кодона TGT к кодону CGA. Один из них проходит через стоп-кодон, а это противоречит принятым правилам молекулярной эволюции: так что этот вариант не учитывается. Но тогда для минимальной эволюции возможен только один путь: на схеме обозначен зелеными стрелками - следовательно, вероятность данного пути p = 1. Поэтому среднее количество наблюдаемых синонимичных замен s_d = s*p = 1, а среднее количество наблюдаемых несинонимичных замен n_d = n*p = 1. Тогда представим имеющиеся данные в виде таблицы:

начальный кодон	TGT
конечный кодон	CGA
S1, число синонимичных сайтов в кодоне TGT	0,5
N1, число несинонимичных сайтов в кодоне TGT	2,5
S2, число синонимичных сайтов в кодоне CGT	1
N2, число несинонимичных сайтов в кодоне CGT	2
s_d, среднее число синонимичных замен	1
n_d, среднее число несинонимичных замен	1

Из этих данных находим значения скоростей синонимичных и не синонимичных замен можно рассчитать двояко:
Первый вариант:
Ks = 0/S1 (путь TGT ->CGT) + s_d/S2 (путь CGT->CGA) = 1/1 = 1
Ka = n_d/N1 (путь TGT ->CGT) + 0/N2 (путь CGT->CGA)= 1/2,5 = 2/5
Тогда отношение Ka/Ks = 2/5:1 = 2/5 < 1. Итак, возможно наблюдается эффект стабилизирующего отбора.
Второй вариант (несколько усложненный):
Ps = s_d/S = 1/1,5 = 2/3
Pa = n_d/N= 1/4,5 = 2/9
Где Ps и Pa - пропорции синонимичных и несинонимичных различий соответственно, а S = S1 + S2*p, N = N1 + N2*p. Я предлагаю суммировать число синонимичных и несинонимичных потенциальных сайтов замен, так как, теоретически, любая замена (син. или несин.) могла произойти на любой из позиций и привести к определенному промежуточному кодону, p - вероятность осуществления данного пути (в моем случае p = 1), поэтому каждое число синонимичных и несинонимичных потенциальных сайтов замен входит со своей вероятностью осуществления. То есть, если необходимо знать среднее число синонимичных и несинонимичных сайтов, то достаточно к числу синонимичных и несинонимичных сайтов в исходном кодоне добавить число синонимичных и несинонимичных сайтов в промежуточных кодонах, нормированное на общее число возможных путей. В принципе, в первом приближении уже эти величины можно считать скоростями синонимичных и несинонимичных замен, и положить, что Ka/Ks = Pa/Ps = 2/9:2/3 = 1/3 < 1, но можно далее использовать формулу однопараметрической оценки скоростей замен Джукса-Кантора: K = -3/4*ln(1-4D/3), и рассчитать эти константы в отдельности (полагая D = Ps в первом случае и D = Pa во втором):
Ks = -3/4*ln(1-4Ps/3) = -3/4*ln(1-4*2/3/3) = 1,65
Ka = -3/4*ln(1-4Pa/3) = -3/4*ln(1-4*2/9/3) = 0,26
Ka/Ks = 0,26/1,65 = 0,16 < 1

Но все равно, при любом способе рассчета отношение скоростей замен получается Ka/Ks < 1, то есть можно предположить преобладание давления стабилизирующего отбора на эволюционный путь этих двух кодонов: TGT -> CGA.

Задание №3. Сравнение давления отбора на разные гены (работа с веб-сервером PAL2NAL)

Выполнение задания придерживается следующей схемы работы:

Выявление круга задач, выполняемых сервером PAL2NAL.
Создание выборки белков ARGB_ECOLI, его одного возможного гомолога, и двух белков из таблицы; также их генов.
Получение выравнивания кодонов с помощью сервера PAL2NAL.
Подсчет отношения Ka/Rs.

Ниже приведен подробный отчет о проделанной работе:

На сервере PAL2NAL было выяснено, что данная программа предназначена для обращения множественного выравнивания белков и соответствующих ДНК (или мРНК) в выравнивание кодонов. Программа автоматически выдает соответствующую последовательность кодонов, даже если входная последовательность ДНК имеет несоответствия с входной последовательностью белка, или содержит нетранскрибируемые терминальные концы (UTRs), полиаденилированные хвосты (polyA). Программа также работает, если в выравнивании ДНК обнаружена frame shift'ы, что очень удобно для анализа псевдогенов. Результат - выравнивание кодонов - в дальнейшем может быть использовано для подсчета скоростей синонимичных (Ks) и несинонимичных (Ka) замен.
Создание выборки белков и их генов:
Последовательность белка ARGB_ECOLI и соответствующего гена argB были взяты из результатов выполнения предыдущих практикумов. Для последовательности белка ARGB_ECOLI был проведен поиск возможных гомологов с помощью программы BlastP со следующими установками: поиск в банке SwissProt, без фильтра "Low complexity". Был обнаружен возможный гомолог - ARGB_BUCAP с ID = 63%. По требованиям задания, необходимо было найти возможный гомолог с ID = 70-80%, но среди последовательностей, попавших в данный интервал, не было ни одной, которая бы соответствовала длине моего белка: 258 a.o.: все они имели длину 257 а.о. Отчего выравнивания по всей длине последовательности белка ARGB_ECOLI просто не получилось бы - в выравнивании обязательно был хотя бы один гэп, что нельзя было допускать. Переходя по ссылке с названием sp|P59098|ARGB_BUCAP на страницу описания его гена на сервере NCBI, далее совершалось перемещение на страницу с описанием белка в банке UniProt по ссылке P59098, где в формате FASTA была получена последовательность белка ARGB_BUCAP. На той же странице был выяснен AC его гена в банке EMBL - AE013218 - и на сервере SRS в поле Quick Search был произведен поиск этого гена. В итоге был получен файл AE013218, в котором среди множества генов, содержался ген белка ARGB_ECOLI (в границах 53489..54265). Чтобы его достать, в строке Unix вводилась следующая команда:
seqret AE013218 -sask
Итак, в ходе этих манипуляций, имеем файл с последовательностью гена белка ARGB_BUCAP. Затем последовательности обоих генов были сохранены в одном файле G1.fasta
На сервере ClustalW было построено попарное выравнивание белков ARGB_ECOLI и ARGB_BUCAP.

Затем с помощью программы Genedoc выравнивание было экспортировано в формат FASTA в файл P1.aa (конечно, такое выравнивание можно было бы получить с помощью программы needle из командной строки Unix, но чтобы его хорошо представить на странице отчета, удобнее получить сперва формат выравнивания .msf, и сделать картинку! :))
В таблице получены АС двух генов: L36552 и L36554. С ними проделывались те же операции, что описаны выше, начиная со стадии поиска на сервере SRS. Итак, полученные гены белков Q25128_Halru и Q25012_9vest (Соответственно их АС L36552 и L36554) сохранены в файле G2.fasta.

Выравнивание белков (приведенное выше) также было получено с помощью программы ClustalW, и также сохранено в формате Fasta в файле P2.aa
На сервере PAL2NAL были получены выравнивания с разбивкой на кодоны для генов из файла G1.fasta, а затем и для генов из файла G2.fasta с помощью следующих операций:
Ввод данных в специально обозначенные поля;
выбор формата результатов "Codon with Amino acid".
Для того, чтобы подсчитать значение отношения Ka/Ks необходимо было поменять следующие установки для программы PAL2NAL (Option setting):
"2.0 Remove gaps, inframe stop codons: Yes" - значения Ka/Ks подсчитываются только для допущения эволюции посредством замен, без вариантов о вставках/делециях.
"2.1 Calculate Ks and Ka: Yes" - программа PAML считает константы скорости синонимичных и несинонимичных замен.
"5. Output format: любой из предоставленных форматов выдачи результата, кроме варианта Codon with Amino acid - в этом случае программа подсчитает константы, но последовательности не будут выравнены из-за отсутствия гэпов и стоп-кодонов внутри рамки (условие №2)"
Для предоставления результатов в пункте 5. был выбран формат "Clustal". В результате константы подсчитаны: для последовательностей из файла G1.fasta и G2.fasta.

Итак, для пары сравниваемых последовательностей генов белков ARGB_ECOLI и ARGB_BUCAP, скорость синонимичных замен Ks = 10.4883 (вообще эта величина при нескольких итерациях изменялась, но не значительно, так что отношение Ka/Ks флуктировало не сильно), скорость несинонимичных замен Ka = 0.2571, так что отношение скоростей равно: Ka/Ks = 0.0245 << 1.
А для пары генов, предложенных в таблице, L36552 и L36554, скорость синонимичных замен Ks = 0.0269, скорость несинонимичных замен Ka = 0.1733, так что отношение скоростей равно: Ka/Ks = 6.4390 > 1.
Вывод:
Из полученных соотношений Ka/Ks можно сделать следующие выводы: В первом случае (для пары последовательностей генов белков ARGB_ECOLI и ARGB_BUCAP): Ka/Ks << 1, что говорит о преобладании давления стабилизирующего отбора на последовательность ARGB_ECOLI - большинство мутаций (путем замен) происходило в синонимичных позициях кодона. Возможно, такая ситуация связана с одной из ключевых ролей белка в метаболизме клетки (все-таки ARGB опосредует одну из реакций орнитинового цикла: ацилирование глутамата, что фактически означает, будет ли клетка синтезировать аргинин), а как, известно, для реализации функциональной активности белка первую роль играет 3D-структура белка: правильный фолдинг, четкое строение активного центра. То есть, третичная структура неким образом "требует" направить отбор в стабилизирующую сторону, в противном случае - возможна потеря функциональной активности (или приобретение иной). Вообще, метаболизм клетки - очень консервативный процесс, и, я думаю, не будет преувеличением сказать, что в основных своих чертах он одинаков для всех живых организмов: от прокариот до эукариот - отличием может служить тот факт, что у эукариот наблюдается тенденция к "централизации" основных биохимических путей на одном - двух сложных белках (обладающих четвертичной структурой). Для проверки этого утверждения, решено было найти возможных гомологов ARGB_ECOLI в составе эукариот с помощью BlastP (с теми же установками, что и первый раз, но поиск только по эукариотам). В результате был найден белок с ID = 34%, из генома хлоропластов красных водорослей: ARGB_PORPU. Проделав те же самые операции, были получены его нуклеотидная и белковая последовательности. И эти данные вместе с последовательностями гена и белка ARGB_ECOLI подавались на вход программе PAML на сервере PAL2NAL для подсчета оценки Ka/Ks. Так что интересно, отношение Ka/Ks = 0.0499 << 1 - давление стабилизирующего отбора!! Конечно, это мог быть случайный результат, да и Rhodophita не далеко ушли (в эволюционном плане) от прокариот (по сравнению, например, с Vertebrata). Но все же это тоже результат. Также хочется отметить, что ARGB_ECOLI и ARGB_BUCAP - ортологи, выполняют одну функцию, но принадлежат разным организмам, и такое отношение Ka/Ks вполне может служить подтверждением этого факта.
Во втором случае (сравнение белков из генов L36552 и L36554) значение Ka/Ks = 6,4390, что является возможным индикатором преобладания давления движущего отбора. В описании обоих белков сказано, что:

оба белка принадлежат организмам одного рода: брюхоногим моллюскам рода Haliotis (галиотисы, или по-нашему "Морские ушки"):
оба белка - Q25012_9VEST и Q25128_HALRU - принимают участие в одном процессе - оплодотворение, первоначально находятся в акросомальном мешочке у спермия. И, возможно, выполняют также одинаковую функцию: в ходе акросомальной реакции, выделевшиеся белки связаваются с рецепторами яйцеклетки (видимо, ими являются особый Zp3-слой блестящей оболочки, состоящий из гликолипидов, протеогликанов, сиаловых, гиалуроновых кислот). Затем эти белки опосредуют слияние мембран спермия и яйцеклетки в последней стадии оплодотворения.
оба белка - предшественники активных форм, имеют в составе сигнальную и основную последовательности.
оба белка принадлежат семейству белков Egg_lysin по классификации InterPro.
длина белков одинакова (149 аминокислот), да и выравнивание аминокислот показывает очень высокое сходство.
Q25128_HALRU весит 17465 Da, Q25012_9VEST весит 17042 Da.
Анализ выравнивания показал, что всего различий в нуклеотидной последовательности есть по ~51-ому нуклеотиду, из них только две замены в синонимичных позициях кодона; также соответствующая белковая последовательность различна по 37-ми аминокислотам. По характеру эти замены распределились так: 21 замена (аминокислотная, 21/37*100% = 56,7%) приводит к совершенно различным по физико-химическим свойствам аминокислотам: A<->E; S<->M и т.п.; 16 (43,3%) - это замены, приводящие к аналогичным по свойству аминокислотам, но с несколько различными размерами: R<->K; L<->V; S<->T; и т.п..

Этот обзор составлен на основании записей Uniprot. Вообще, на мой взгляд, для этих белков наблюдается очень необычная ситуация: имея довольно очень сходные аминокислотные последовательности (возможно, даже гомологи?), их гены показывают значительное давление движущего отбора!!!! В принципе, это понятно, почему наблюдается такое несоответствие: различия в аминокислотных последовательностях почти на 45% приходятся на родственные по физ/хим. свойствам аминокислоты, причем сохраняются не только относительные размеры аминокислот (замены типа I<->M; Y<->F), но и заряд (замены типа K<->R). Понятное дело, что функционально важные свойства (активность, оптимум рН, температуры и др.) белков вряд ли изменятся. Но может поменяться (очень незначительно) субстратная специфичность: небольшие изменения в химическом окружении связывающего сайта вполне достаточно для узнавания других классов гликопротеогликанов. Вообще, у меня два взгляда на возможные причины наблюдаемого факта. Во-первых, в данном примере мы имеем дело с взаимодействием "лиганд-рецептор", который к тому же осуществляется между двумя клетками разных организмов (спермия и яйцеклетки). Соответственно, состояние системы и её участников уже определяется не каждым в отдельности, а в совокупности: то есть если меняется рецептор, то должен адекватно измениться лиганд и наоборот (но только в том случае, если нет альтернатив). Поэтому, если в определенный момент в рецепторном слое яйцеклетки появляются новые виды рецепторов - протеогликанов (например, различающихся числом остатков углеводов в цепи), то для более эффективного взаимодействия, спермию необходимо иметь соответствующий тип лигандов: например, комплементарных белков семейства Egg_lysin. И тогда достаточно небольших модификаций исходной молекулы, чтобы "настроить" их на узнавание новых рецепторов. Таким образом, можно предполагать коэволюцию для рецепторов яйцеклетки и лигандов спермия. Другой взгляд на данную проблему касается особенностей полового процесса у брюхоногих. Если мне не изменяет память, у них внешнее оплодотворение, происходящее в мантийной полости в результате попадания туда гамет самца и выброса самкой своих. Тогда понятное дело встает проблема защиты организмов от межвидового спаривания, которое может обеспечиваться на разных стадиях: дальнее взаимодействие спермия с яйцеклеткой, первичное (контактное) взаимодействие (как раз комплементарной системой "рецептор - лиганд"), слияние гамет. Оба белка Q25012_9VEST и Q25128_HALRU, возможно, опосредуют слияние спермия с яйцеклеткой. В этом случае большая степень вариабельности структуры родственных по функции белков, в пределах допустимого, может способствовать устойчивости от межвидового оплодотворения: чем больше вариантов "правильных" лигандов к рецепторам, тем меньше риск проникновения "чужого" спермия к яйцеклетке. Но тогда прогрессирующее давление движущего отбора может в дальнейшем настолько изменить последовательности белков, что, учитывая также первое утверждение (о коэволюции рецептора - лиганда), возможно разделение одной популяции в две не спаривающиеся между собой популяции. Видимо, следующие наблюдаемые факты: консервативная последовательность белка, выполняющего очень важную функцию в эволюционном плане: размножение, и положительный (движущий) отбор - вполне могут служить признаками видообразования: если такие "незначительные" мутации ведут к изоляции двух подпопуляции в составе одной большой популяции (см. рисунок) - даже если достаточно изменений в последовательностях белков-андрогамонов, опосредующих слияние мембран гамет - то этого вполне хватит, что бы запустить процесс разделения вида в одной экологической нише.

голубым цветом показана популяция с одним типом белка спермия, желтым - популяция
с сильно мутировавшим белком спермия, красным - перекрывающиеся зоны популяций, которые в
процессе эволюции вымирают из-за неспособности представителей производить потомство:
межпопуляционные спаривания не осуществляются, так как сильно мутировавшие спермиальные
белки не способны оплодотворять яйцеклетки, принадлежащие разным самкам разных популяций.

Вообще получается классическая схема эволюции: исходно описание давалось явлению высокой консервативности белков при действии движущего отбора, которым можно дать одно определение - адаптация моллюсков к внешнему оплодотворению при свободном спаривании в морской среде; глубокая адаптация (сильное обособление аминокислотных последовательностей), может служить причиной изоляции двух популяций и в конечном итоге - появлению двух видов.
И наконец, третья точка зрения на эти два белка. Если эти белки выполняют разные, но довольно близкие функции - они четко не прописаны в SwissProt'e - например, один белок обеспечивает слияние мембран, а другой - контактное взаимодействие гамет, то тогда можно предположить о тесном родстве данных белков: может это паралоги, произошедшие в результате дупликации одного из генов белков и впоследствии эволюционировавшего в последовательность похожего белка, но с иной функцией. Но для проверки данного утверждения, необходимо и достаточно будет то, что белки похожи по первичной, вторичной и третичной структурам и иметь отличные функции. Действительно, по первичной структуре белки очень похожи (см. рис. выше) и позволяют говорить о возможной гомологии. Что касается двух других пунктов, то был проведен поиск программой BlastP возможных гомологов с известной 3D-структурой. На вход подавалась последовательность Q25128_HALRU, поиск производился по базе данных структур pdb. В итоге найден белок: 1GAR, c характеристиками выравнивания: ID = 27%, e-value = 7e-12

Score = 65.1 bits (157),  Expect = 7e-12
 Identities = 36/129 (27%), Positives = 65/129 (50%), Gaps = 3/129 (2%)

Query  23   VSKENAAAMKVAMIKFLDSRTDRFKKRIEKIGYPITPPQYTTLLYYNRERLMDWCHNYVE  82
            VS++  + ++  M+ FLD    +  KR   + + + P     L   NRER+M +C +Y  
Sbjct  6    VSRQEQSYVQRGMVNFLDEEMHKLVKRFRDMRWNLGPGFVFLLKKVNRERMMRYCMDYAR  65

Query  83   VSKKIILLGGNKLNKKNFARMGRIIGWKNQWILKRRQWHMVRVMRRY---KASAIAKKIV  139
             SKKI+ L    +NKK   +MGR +G++N  +++     + R ++ +   K +A  +K  
Sbjct  66   YSKKILQLKHLPVNKKTLTKMGRFVGYRNYGVIRELYADVFRDVQGFRGPKMTAAMRKYS  125

Query  140  AMKVADLPC  148
            +      PC
Sbjct  126  SKDPGTFPC  134

Затем все три белка: Q25012_9VEST, Q25128_HALRU, 1GAR - были выравнены программой ClustalW и выравнивание сохранено в .msf формате:

В этом выравнивании добавлена ещё одна строка со вторичной структурой: "H" - положение альфа-спирали; "signal_peptide" - положение сигнального пептида. Как можно заметить, последовательности обоих белков очень хорошо выравниваниются между собой и структурным файлом, что позволяет перенести элементы вторичной структуры 1gak файла на последовательности исследуемых белков. К тому же большинство замен на одинаковые по физ/хим. свойствам аминокислоты расположены в спиралях, а замены на совершенно разные аминокислоты преимущественно (но не генерально) расположены в петельных участках:

Но схожесть по первичной и вторичной структурам ещё не говорит об одинаковой топологии вторичных элементов и соответственно о трехмерной укладке. Поэтому в качестве проверки схожести трехмерной структуры решено было построить трехмерные структуры программой Swiss-Model: если программа построит 3D-модели белков Q25012_9VEST и Q25128_HALRU с помощью одного и того же pdb-файла, то это и будет свидетельствовать о сходжести 3D-структур. Действительно, программа для обоих последовательностей построила структурные файлы на основании одного и того же pdb: 1GAK.pdb. Для белка Q25128_HALRU найдена структура 1gak.pdb с уверенностью P(n) = 2e-10, а для Q25012_9VEST: P(n) = 2e-07.Поэтому, по принятому критерию, можно говорить о сходстве 3D-структур. Итак, если белки Q25012_9VEST и Q25128_HALRU действительно имеют различные функции, то по сходству первичной, вторичной и третичной структур можно уверенно спекулировать о том, что они - паралоги. Возможно, что один ген дуплицировался, и перед нами результат накопления множества мутаций одной копией гена, приведшей к появлению нового белка с иными свойствами.