PSI-BLAST

1. Поиск гомологов белка LGB1_LUPLU (P02239) в БД SwissProt.

• Без учета особенностей аминокислотного состава: No compositional adjustments;
• фильтр на области низкой сложности Low complexity;
• максимальное значение E-value = 10;
• максимальное количество находок: Number of Descriptions=1000.

1. гомологов среди ECOLI k-12 найдено не было,
2. в протеоме человека было найдено три белка, правда E-value которых больше единицы, поэтому считать эти последовательности гомологами не стоит.

2.Поиск с помощью программы PSI-BLAST гомологов LGB1_LUPLU (P02239) в БД SwissProt.

• Без учет особенностей аминокислотного состава: No compositional adjustments;
• фильтр на области низкой сложности Low complexity;
• максимальное значение E-value = 10;
• максимальное количество находок: Number of Descriptions=1000.

• Для решения каких задач нужно использовать PSI-BLAST? На мой взгляд, PSI-BLAST можно использовать в следующих случаях. Во-первых, во время поиска возможных гомологов данного белка и даже довольно далеких гомологов белка. Так как для поиска PSI-BLAST строит на каждой итерации матрицу замен PSSM, то есть высокая доля вероятности установить даже отдаленную гомологию между белками. Действительно, PSSM - это прямоугольная таблица, состоящая из n-колонок, соответствующих количеству позиций в множественном выравнивании, для которого PSSM строится, и 20-ти строчек (по числу аминокислот) (возможен обратный вариант, как это осуществлено в нашем случае: см. ниже). В каждой ячейке этой матрицы записан вес для каждой аминокислоты нахождения на данной позиции во множественном выравнивании. В принципе, эту величину можно приближенно считать частотой данной аминокислоты в данной позиции. То есть, в отличие от BLOSUM62, PSSM может отражать "функциональную гомологию". Действительно, мы знаем, что треонин очень структурно похож на серин, и в матрице BLOSUM62 замены типа S-T имеют высокий вес, в отличие, например, S-F. Но если этот серин является каталитически важным (как в сериновых протеазах), то он более вероятно будет замещаться цистеином, а не треонином (большие экспериментальные данные говорят о гомологии цистеиновых и сериновых протеаз). Таким образом, применяя матрицу замен BLOSUM62, можно просто пропустить настоящую гомологию!!!
  Во-вторых, имея в распоряжении последовательность нового, только что секвенированного белка, можно попытаться в первом приближении установить принадлежность этого белка к определенному суперсемейству, установить функциональные и структурные домены, локализацию в клетке, и соответственно попытаться спекулировать ролью этого белка в клеточном метаболизме. В-третьих, PSI-BLAST можно использовать для конструктирования матриц PSSM, с помощью которых в дальнейшем можно сканировать иные базы данных (например PFAM) для дополнительного выявления гомологий.
• Что представляет собой первая итерация PSI-BLAST? Первая итерация - простой поиск возможных гомологов программой BLASTP. Действительно, без множественного выравнивания невозможно построить матрицу PSSM (так сказать, без "экспериментальных данных" нет и выводов), поэтому для сканирования БД необходимо использовать какую-либо из стандартных матриц замен (типа BLOSUM62, PAMs), а это есть не что иное, как обычное использование программы BLASTP.
• Что удалось найти с помощью PSI-BLAST? Я полагаю, в ходе выполнения упражнения №2 были получены наиболее вероятные гомологи LGB1_LUPLU (как паралоги, так и ортологи) с достаточно доверительным E-value = 0,005, причем все найденные белки глобулярные и принадлежат одному семейству белков - Globine. Действительно, этот параметр определяет е-value, необходимое для HSP (High scoring pairs - те самые кластеры, с помощью которых строится множественное выравнивание) чтобы быть включенным в строящееся множественное выравнивание, необходимое для создания PSSM. Соответственно, комбинируя и inclusion threshold=0,005 и также фильтр в области низкой сложности (или более лучше с composition-based statistics) можно добиться действительно точных результатов нахождения гомологов, принадлежащих одному семейству белков.
• Что происходило с "лучшими находками" на разных итерациях? Анализируя таблицу №2, можно заметить, что от 1 к 5-ой итерации:

1. У лучшей находки в протеоме ECOLI K-12: HMP_ECOLI, значение e-value увеличивается, причем одновременно уменьшается % идентичности и длина выравнивания.
2. У лучшей находки в протеоме человека: HBG2_HUMAN, начиная со второй итерации (в первой была найдена другая находка, не соответствующая дальнейшим: NGB_HUMAN) видна иная картина: значение e-value уменьшается, а длина выравнивания увеличивается (процент идентичности фактически не меняется).

• Возможны две стратегии. Первая состоит в том, чтобы на каждой итерации вести поиск по всем организмам. Вторая состоит в том, чтобы после первой итерации отфильтровать находки по интересному для Вас таксону, и затем запустить следующие итерации. Какие отличия можно ожидать в результатах? Возможно, можно ожидать следующее. Если мы на каждой итерации ведем поиск по всем организмам, то матрица PSSM, используемая для сканирования БД, будет включать в себя особенности частот определенных аминокислот на данных позициях в множественном выравнивании на основании белков из всех организмов, отчего найденных гомологов из интересующего таксона будет немного. Если же после первой итерации вести поиск по определенному таксону, то за счет использования более специфичной матрицы PSSM для данного таксона, будет найдено большее количество гомологов, нежели чем в первой стратегии, причем можно с большой вероятностью заметить в матрице PSSM отражение консервативных аминокислот: очевидно, значения весов замен консервативных аминокислот на отличные аминокилоты будет низким.
• Определить, какие остатки контактируют с гемом в "лучших" находках среди белков человека. Проверить, сохраняются ли эти аминокислотные остатки в LGB1_LUPLU, а также в "лучшей" находке среди белков Escherichia coli K-12. Сделать выводы из полученных результатов. С гемом среди белков человека контактируют остатки 63, 92; в самом белке LGB1_LUPLU это остатки 63, 97; в белке из протеома ECOLI HMP_ECOLI это остаток 85. В принципе, остатки вполне сохраняются приблизительно в одной микрообласти, отчего данные белки были идентифицированы как гомологи LGB1_LUPLU.
• Описание файла с профилем PSSM Файл с профилем PSSM можно взять здесь. Профиль PSSM представляет собой матрицу, состоящюю из 154 строк и 21 столбца. Строки соответствют позициям последовательности леггемоглобина-1 Lupinus luteus. 20 столбцов несут информацию о частоте встречаемости данной из 20-ти аминокислот во множественном выравнивании на каждой позиции последовательности белка. Последний столбец содержит штрафы за делеции или вставки. В принципе, данную матрицу можно использовать для поиска возможных гомологов, представителей того же семейства белков, что и исследуемый белок в базах данных PROSITE, PRODOM и др. Данные этой матрицы можно также использовать для идентифицирования консервативных остатков, которые возможно несут определенную функцию, или просто являются структурообразующими. Также она позволяет оценить границы гидрофобного ядра, так как тогда замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные будет маловероятной, отчего и значение соответствующей замены будет малым.