UniProt

1.Введение

Пролин – дегидрогеназа (EC:1.5.5.2) – это фермент, который участвует в двухстадийном превращении пролина в глутамат, катализируя первую стадию. Кофактором пролин – дегидрогеназы является FAD (рисунок 1). Структура белка состоит из двух цепей, каталитический центр фермента имеет форму цилиндра, на карбоксильных концах которого и происходит связывание кофактора FAD с каждой белковой цепью.[1] В Thermus thermophiles, откуда фермент был получен, он катализирует следующую реакцию: a quinone + L-proline = (S)-1-pyrroline-5-carboxylate + a quinol + H+ (рисунок 2). [2]

FAD — *Рисунок 1.*Флавинадениндинуклеотид

cycle — *Рисунок 2.*Превращение L - пролина в глутамат

Thermus thermophiles – это грамотрицательные бактерии из семейства Thermaceae, порядка Thermales [3], которые являются важным модельным объектом в биоинженерии, биотехнологии и других областях науки. Этот организм обитает в условиях с экстремально высокими температурами (от 65 до 72 градусов Цельсия), впервые Thermus thermophiles был найден в геотермальном источнике города Изу, Япония. Типовой штамм бактерии - HB8.[4] Этот вид бактерий хорошо подвержен воздействию различных растворителей, а также механизм работы пролин – дегидрогеназы в Thermus thermophiles сходен с таковым в эукариотических клетках, поэтому для выделения данного фермента используют именно Thermus thermophiles. [1]

На данном апплете представлены цепи пролин – дегидрогеназы, покрашенные в разные цвета (color chain), а также молекулы FAD (select FAD, cpk 70, wireframe 50, color cpk). Скрипт Вы можете увидеть по следующей ссылке: Скрипт

2.Таблица с информацией о белке

В данной таблице представлена общая информация о белке, полученная с помощью Uniprot.

Характеристика белка	Результаты
UniProtKB	Swiss-Prot
UniProt ID	PRODH_THET2
UniProt AC	Q72IB8
EMBL AC	AE017221; AAS81556.1; -; Genomic_DNA
Gene names	TT_C1214
Length	307 AA
RecName	Full: Proline dehydrogenase Short: PRODH EC: 1.5.5.2
Известна структура всего белка.

Таблица 1. Информация о белке.

3.Результаты поисковых запросов к UniProt

В этом разделе обсуждаются результаты поисковых запросов в UniProt. Запросы и результаты можно посмотреть по ссылке в таблице 2.

При помощи UniProt мы изучали:

представленность пролин – дегидрогеназы у разных систематических групп;
представленность белков в целом и пролин – дегидрогеназ в частности у Thermus Thermophilus;
поиск информации о способе получения белка и информации о его функциях;
биотехнологическое значение Thermus Thermophilus.

Выводы по данным запросам:

Пролин – дегидрогеназа широко представлена у разного рода организмов (запрос 1), она встречается как и у бактерий (запросы 2-6), так и у эукариотических организмов (запрос 12). У Thermus Thermophilus имеется большое разнообразие белков (запрос 7), в том числе 9 различных пролин – дегидрогеназ (запрос 8), однако только пролин – дегидрогеназа (EC:1.5.5.2) представлена в UniProt в секции Swiss-Prot, то есть информация о ней проверена и дополнена. Как видно из запросов 9 и 10, ген TT_C1214 кодирует в семействе Thermaceae только один фермент, этот ген ассоциирован исключительно с пролин – дегидрогеназой (EC:1.5.5.2) (запрос 13). Запросы 14 – 16 показывают, что в исследованиях был выделен и изучен данный конкретный белок, были предсказаны его функции, а также при исследовании работы белка была использована информация о гомологичных белках. Поскольку Thermus Thermophilus имеет важное значение, как модельный объект в биологии, был также сделан 17 запрос. Он показал, что в биоинженерии используется термостабильная ДНК – полимераза I, выделяемая из данной бактерии.

Далее были изучены кластеры UniRef50, UniRef90 и Uniref100 для пролин - дегидрогеназы. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Исследование кластеров UniRef.

Раздел UniRef	Cluster ID	Cluster name	Size	Swiss - Prot	UniParc
UniRef50	UniRef50_Q72IB8	Cluster: Proline dehydrogenase	77	1	76
UniRef90	UniRef90_Q72IB8	Cluster: Proline dehydrogenase	15	1	14
UniRef100	UniRef100_Q72IB8	Cluster: Proline dehydrogenase	3	1	2

Выводы по UniRef:

В результаты запросов было выявлено, что изучаемый белок в каждом кластере является репрезентативной последовательностью. Таким образом, именно он используется для аннотации всего кластера, то есть указываются его название и длина. Это значит, что изучаемая последовательность представляет собой проверенную вручную (находящуюся в базе данных Swiss - Prot), аннотированную, выделенную из модельного организма аминокислотную последовательность. Также важно отметить, что исследуемая последовательность не является самой длинной, что обычно предпочтительно для репрезентативной.

Кластер Uniref50 довольно большой (size 77), что говорит о распространённости нашего белка. Однако в основном исследуемый белок встречается у других видов рода Thermus, что говорит о небольшом разнообразии таксонов, в которых его можно встретить.

4.Сравнение протеомов

Довольно часто термостабильные бактерии являются модельными объектами в биологии. Кроме исследуемой Thermus thermophiles, широко используется Methanocaldococcus jannaschii - строго говоря, термостабильная метаногенная архея.[5] Это также первая архея, чей геном был полностью отсеквенирован и изучен. В работе было проведено сравнение этих широко используемых модельных объектов, изучены их протеомы и представленность различных видов белков в них. Результаты можно увидеть в таблице 4.

Таблица 4. Сравнение протеомов.

Организм	ID протеома	Общее количество белков	Количество белков в Swiss - Prot	Трансмембранные белки	Ферменты	Термостабильные белки
Thermus thermophilus (strain HB27 / ATCC BAA-163 / DSM 7039)	UP000000592	2200	376	385	733	5
Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440)	UP000000805	1787	1787	294	582	48

Увидеть запросы можно по ссылке.

Как видно из результатов работы, в Thermus thermophiles больше белков, однако только их маленькая часть (376) находится в базе Swiss - Prot, то есть аннотирована и описана. В архее же в Swiss - Prot находятся все белки (поскольку это часто используемый модельный объект). В изучаемой бактерии больше трансмембранных белков и ферментов, чем в Methanocaldococcus, однако в архее больше термостабильных белков, что можно объяснить обитанием в более суровых условиях, сходных с условиями на поверхности ранней Земли.[6]

5.Дополнительная информация, полученная с помощью UniProt

Первая запись о пролин – дегидрогеназе была сделана 5 июля 2004 года, до 2016 года все записи о белке делались автоматически (TrEMBL), но, начиная с 84 записи, фермент записывается в секции Swiss-Prot. Последняя запись была сделана 7 апреля 2021 года. Всего на странице UniProt нашего белка 106 записей, можно найти информацию как в формате txt, так и в формате fasta.

UniProtKB может дать много сведений о изучаемом белке. В поле CC находится информация о различных функциях и свойствах фермента. В строчке FUNCTION содержится краткое описание процессов, где принимает участие белок, в CATALYTIC ACTIVITY написана реакция, катализируемая пролин – дегидрогеназой, COFACTOR включает в себя информацию о FAD, ACTIVITY REGULATION – о путях регуляции фермента. В строчке BIOPHYSICOCHEMICAL PROPERTIES находятся различные физико – химические характеристики белка (например, константа Михаэлиса - Ментен для L- пролина равна 27 mM, электродный потенциал равен -75 mV). В PATHWAY указаны метаболические пути, где участвует пролин – дегидрогеназа. SUBUNIT описывает четвертичную структуру (гомодимер), SIMILARITY содержит в себе информацию о семейству, к которому принадлежит фермент.

В поле FT содержится информация о вторичной структуре белка. Там указывается, какие участки аминокислотной последовательности образуют альфа – спираль, поворот или остаются в виде цепи. Также там можно найти данные об активном сайте фермента и кофакторе FAD.

Практикумы 8 и 10. UniProt

1.Введение

2.Таблица с информацией о белке

3.Результаты поисковых запросов к UniProt

4.Сравнение протеомов

5.Дополнительная информация, полученная с помощью UniProt

6.Литература