UniProt

Выбор белка

Для поиска белков Clostridioides difficile я использовала расширенный поиск на сайте UniProt. В поле Organism [OS] я ввела Clostridium difficile, после чего из предложенных вариантов выбрала Clostridioides difficile (Peptoclostridium difficile) с таксономическим идентификатором 1496. Затем в поле Strain указала номер штамма 630.

Всего по данному запросу было найдено 30 записей. При просмотре результатов мое внимание привлекли токсин A и токсин B, поскольку я встречала множество упоминаний о них в литературе при подготовке обзора. Кроме того, оба белка имеют максимальную оценку аннотирования 5/5, что свидетельствует о высоком качестве и полноте их аннотации.

Из двух токсинов я выбрала токсин B (TcdB, Entry P18177), так как его ферментативная активность значительно выше, чем у токсина A, что делает его более интересным объектом для анализа.

Информация о белке

Перевод названия: Токсин B

Основные функции:

1. Поражение кишечника: Токсин воздействует на эпителий толстой кишки, вызывая воспаление, врожденный иммунный ответ, диарею и псевдомембранозный колит.

2. Глюкозилтрансферазная активность: Активная форма токсина (Glucosyltransferase TcdB) модифицирует (глюкозилирует) малые GTP-азы семейства Rho (такие как RhoA, Rac1, Cdc42) в клетках хозяина.

3. Разрушение цитоскелета: Глюкозилирование блокирует эти белки в неактивном состоянии, что приводит к разрушению актинового цитоскелета и гибели клеток.

4. Механизм проникновения: Токсин связывается с рецепторами на поверхности клеток (например, FZD1, FZD2, FZD7, CSPG4), проникает внутрь через эндоцитоз и высвобождает свой активный домен в цитозоль путем саморасщепления (автопроцессинга).

Поисковые запросы

Запрос №1: ft_mutagen:* AND organism_id:1496 AND reviewed:yes (поиск белков с экспериментальными мутациями)

Я использовала поле Mutagenesis [FT] (ft_mutagen) для поиска белков Clostridioides difficile, в аннотации которых есть информация об экспериментально полученных мутациях. Звёздочка (*) означает «любое значение», то есть я искала белки, у которых вообще есть хоть одна описанная мутация. Поле ft_mutagen является одним из самых специфичных и редко используемых в расширенном поиске UniProt. Оно показывает, что для белка проводились дорогостоящие и трудоёмкие эксперименты по точечному мутагенезу, что является маркером его высокой научной и клинической значимости.

Дополнительно я ограничила поиск:

organism_id:1496 — только белки Clostridioides difficile (таксономический ID этого вида)

reviewed:yes — только вручную проверенные записи Swiss-Prot (самый высокий уровень достоверности)

Вывод: всего 3 белка C. difficile в базе Swiss-Prot имеют аннотированные мутации. Два из них — токсины A и B — основные факторы вирулентности этого патогена. Третий белок (HadA) участвует в метаболизме аминокислот.

Запрос №2: gene:tcdB AND organism_id:1496 AND reviewed:yes (поиск по имени гена)

Я использовала поле Gene Name [GN] (gene) для поиска белков Clostridioides difficile, которые кодируются геном tcdB. Этот ген отвечает за синтез токсина B (TcdB) — основного фактора вирулентности.

Вывод: всего 2 белка C. difficile в базе Swiss-Prot кодируются геном tcdB. Оба представляют собой токсин B, но из разных штаммов:

P18177 – из штамма 630 (мой белок;

Q9EXR0 – из другого штамма (вероятно, с незначительными вариациями в последовательности, отсюда разница в длине 2366 против 2367 AA).

Это подтверждает, что ген tcdB и кодируемый им белок являются повсеместно распространённым и ключевым компонентом патогенности C. difficile, присутствуя в различных клинических штаммах.

Запрос №3: ft_domain:"Peptidase C80" AND reviewed:yes (поиск белков с доменом автопротеолиза)

Я использовала поле Domain [FT] (ft_domain) для поиска белков, содержащих домен Peptidase C80. Этот домен отвечает за автопротеолитическое расщепление — механизм, при котором белок «сам себя разрезает» после попадания в клетку хозяина, активируя свою токсическую часть. В аннотации моего белка в разделе FT DOMAIN указано, что аминокислоты 567–774 образуют именно этот домен.

Вывод: домен Peptidase C80 обнаружен у 9 белков в базе Swiss-Prot. Все они представляют собой крупные токсины, принадлежащие к двум семействам:

Клостридиальные глюкозилтрансферазы (TcdA, TcdB, TcsL) – токсины, модифицирующие малые ГТФазы клеток хозяина;

MARTX-токсины вибрионов (Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae) – многофункциональные токсины с различными механизмами действия.

Это подтверждает, что механизм автопротеолитической активации (саморазрезания) является эволюционно консервативной стратегией, независимо возникшей у разных семейств бактериальных токсинов. Для C. difficile этот домен присутствует у двух главных факторов вирулентности — токсинов A и B (3 записи из 9 относятся к C. difficile), что подчёркивает их эволюционное родство и общий механизм активации.