МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА
ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ

Домашняя страничка Ильи Курочкина

Поиск белка с заданной функциональной специфичностью

Первый этап: описание функциональных особенностей заданной группы

Был выдан белок-прототип MALI_ECOLI. Белок выделен из бактерии Escherichia coli K-12 Имя гена - malI, длина последовательности 342 аминокислотных остатков.

Доменная структура белка MALI_ECOLI (информация из БД Pfam):

Cхема из Pfam:
Пояснения к схеме
Pfam AC	Pfam ID	Положение в последовательности белка MALI_ECOLI	Клан
PF00356	LacI	8-53	HTH (CL0123)
PF00532	Peripla_BP_1	64-342	Periplas_BP-like (CL0144)

В БД EcoCyc был произведен поиск информации о данном белке. Была найденна страница с описанием белка MALI_ECOLI.

Транскрипционный фактор malI (Мальтозный репрессор) отрицательно саморегулируется и контролирует транскрипцию оперона, который кодирует мальтоза-глюкоза PTS пермеазу (фермент, участвующие в транспорте метаболитов) и бифункциональный белок, который взаимодействует с активатором транскрипции MalT.

Термины GO, связанные с белком MALI_Ecoli:

GO	Онтология GO (название словаря)	Термин
GO:0006355	biological process	regulation of transcription, DNA-dependent
GO:0045449	biological process	regulation of transcription
GO:0006350	biological process	transcription
GO:0003677	molecular function	DNA binding
GO:0003700	molecular function	transcription factor activity
GO:0005622	cellular component	intracellular

Где? (cellular component)	Внутриклеточный
Зачем, для чего? (biological process)	Транскрипция; регуляция ДНК-зависимой транскрипции
Молекулярный механизм? (molecular function)	Связывание с ДНК; активность транскрипционного фактора
Специфичность? (molecular function)	-

Таким образом, в аннотации GO нет ни слова об эффекторе белка MALI_ECOLI - мальтозе.
Структурная формула мальтозы (БД KEGG, ID C00208):

Второй этап: создание множественного выравнивания доменов с разметкой по группам специфичности

Создание хорошее множественное выравнивание доменов заданной группы белков

Посмотрим на разметку всех мотивов для белка прототипа MALI_ECOLI в БД InterPro. Используем домен из БД SMART, так как длина ДНК-связывающего домена SM00354 из БД SMART превосходит длины ДНК-связывающих доменов из других баз. Таким образом, мы получим больше информации. В таком случае его можно будет впоследствии "отрезать". Если бы были выбраны домены из другой БД, то часть информации могла потеряться.

Затем перешли по ссылке SM00354. Представительское выравнивание сохранено в файл SMART.fasta.

Последовательности всех бактериальных белков, содержащих домены данного семейства были сохранены в формате FASTA в файл family.fasta.
Был получен список идентификаторов последовательностей, по мнению эксперта, обладающих данной специфичностью. Было обнаружено, что в файле family.fasta, полученном из БД SMART, отсутствует один белков, указанных в списке идентификаторов последовательностей, по мнению эксперта, обладающих данной специфичностью. Эта последовательность была получены из БД UniProt.

Был запущен скрипт script.txt:

	#!/bin/bash
	for i in `cat mali`; do
	grep -A 5 ${i} family.fasta >> family_sort.fasta
	done

Данный скрипт ищет в файле family.fasta последовательности из списока, лежащего в файле mali. Для правильной работы скрипт и список должны быть сохранены в UNIX-формате. Выдача скрипта: файл family_sort.fasta. Затем к данному файлу была приписанна последовательность белка B5XRE8.

С помощью программы ClustalW2 последовательности белков, содержащих нужные ДНК-связывающие домены были выровнены под профиль представительского выравнивания SMART.fasta. В результате чего были получены: файл с выравниванием и файл с деревом. Из файла с выравниванием были вырезаны представительские последовательности и позиции выравнивания, не содержащие ДНК-связывающего домена. Полученное выравнивание было сохранено в файл dna_mali.fasta

Создание единое множественное выравнивание заданных доменов всех групп специфичности

Импортируем выравнивания всех групп специфичности в GeneDoc с раскраской по группам отдельно для ДНК-связывающих доменов и для эффекторных доменов. А также удалим колонки с гэпами для удобства просмотра. Последовательности доменов заданной группы специфичности mali расположены наверху, названия содержащих их белков окрашены в красный цвет. В другие цвета окрашены названия белков, содержащих домены разных групп специфичности (например, названия белков с доменами группы специфичности frur окрашены в светло-зелёный цвет, galrs - в салатовый цвет и т.д.). Колонки букв, окрашенные цветом, совпадающим с цветом названия белков указывают на позиции, консервативные в доменах соответствующей группы специфичности. Позиции, консервативные в доменах всех групп специфичности, окрашены в черный цвет. Для заданной мне группы MALI позиции характерные только для неё, покрашенные в светло-красный цвет. Для нахождения консервативных позиций была нажата кнопка "D", в результате чего буквы в позициях, соответсвующих консенсусу всего выравнивания были заменены на точки. Были выбраны позиции двух типов: консервативные внутри группы и не заменённые точками; консервативные внутри группы и заменённые точками, но не консервативные в других последовательностях.

Эффекторный домен: effect.png. Выравнивание сохранено в файле effect.msf.
Консервативна для всех белков семейства только позиция: лейцин/изолейцин/валин/метионин 146. Для изучаемой группы специфичности были найдено 35 консервативных позиций:

Позиции Аминокислотные остатки
65 S, T
69 E
74 L, M
76 F
87 G
169 P
176 A
181 T
209-210 SL
214 A
220 G
223 C
225 T, S
228 L, V, M
230 Y, F
232 G
235-236 PF
248 E
250 C
257 Q
261 A
280 V, I
297-298 YG, FG
305 R
310 G
322 Q
326 L
329 F
331 D
337 L
344 F, W
346 S, T

ДНК-связывающий домен: dna_bind.png. Выравнивание сохранено в файле dna_bind.msf.
Позиции, консервативные для всего выравнивания: серин 19, лейцин/изолейцин/валин (метионин только в одной последовательносте) 22, валин/изолейцин 39, тирозин/фенилаланин 48. Для изучаемой группы специфичности были найдено две консервативных позиции (лизин 28 и глицин 29).

Создание лого-изображения полного выравнивания заданных доменов и выравнивания доменов заданной группы специфичности

ДНК-связывающий домен:

Logo для полного выравнивания: logo_dna.png
Logo для выравнивания группы mali: logo_mali_d.png

Эффекторный домен:

Logo для полного выравнивания: logo_effect.png
Logo для выравнивания группы mali: logo_mali_e.png

Третий этап: поиск белка заданной группы специфичности в протеоме заданного организма

Был задан протеом организма Bacillus thuringiensis. На сервере SRS были получены последовательности всех белков из TrEMBL с ID: _BACTU, соответствующими белкам данного организма. Используем БД TrEMBL, так как в ней имеется информация обо всех возможных, ещё не аннотированных белках. Для дополнительной проверки важных позиций, воспользуемся БД PDB. К сожалению, в БД PDB не нашлось ни одной 3D-структуры белка группы специфичности mali. Поэтому был скачан файл 1BDH, содержащий структуру белка из другой группы специфичности purr*. Будем считать, что разные группы специфичности связываются с ДНК схожим образом одними и теми же остатками.
Последовательно были выполнены следующие программы:

pfw - для добавления весов в выравнивание группы специфичности
pfmake - для составления профиля группы специфичности
autoscale - для нормирования этого профиля
pfsearch - для для поиска последовательностей в протеоме по профилю (со значением порога 16.0 для ДНК-связывающего домена и 27.0 для эффекторного домена)
ClustalW2 - для выравнивания найденных последовательностей под выравнивание семейства

ДНК-связывающий домен: bac_thu_dna.msf, bac_thu_dna.png

Были найдены 27 последовательсностей. Среди них многие последовательсности оказалисьидентичных с разными AC. Поэтому в выравнивание оставлена только 4 уникальных последовательности. Некоторые позиции в найденных последовательностях не совпадают с консервативными в группе. Кроме того среди специфических для данной группы позиций, в найденной последовательности есть только одна совпадающая позиция (Gly 26) показана красным.
Для проверки воспользуемся файлом 1BDH
Цепь A - белковая(голубая), цепь B - ДНК (расскраска по элементам), эффектор: гипоксантин (красным)

С помощью запроса в PyMOL: select contact, (c. a&!r. HOH&!r. HPA) w. 4.0 of (c. b)
Были выбраны атомы ДНК-связывающего домена, находящиеся на расстоянии не более 4 ангстрем от ДНК. Гидрофобные и гидрофильные взаимодействия не различались. Это позиции Val13-Thr17, Arg26-Thr32, Leu54-Ala55. Позиции 15, 30 и 31 не были найдены, но были добавлены, так как находятся между другими позициями, определяющими специфичность. Не все из этих позиций совпадают в найденной последовательности с группой специфичности, но совпадающие позиции не являются специфичными только для данной группы.

Эффекторсвязывающий домен: bac_thu_effect.msf, bac_thu_effect.png

Были найдены 23 последовательсностей. Среди них многие последовательсности оказалисьидентичных с разными AC. Поэтому в выравнивание оставлена только 3 уникальных последовательности. Консервативных в группе позиций, совпадающих в найденных последовательностях, меньше половины от всех консервативных. Количество совпадений (покрашены красным) с специфическими позициями невелико.

Вывод

По данным результатам можно сделать вывод, что в протеоме Bacillus thuringiensis нет белков, имеющих ДНК-связывающих и эффектор-связывающих доменов группы специфичности mali, то есть нет белка-репрессора мальтозного оперона.

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ