NA

Практикум 13. Bedtools

Обязательная часть

Команды:

/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtobed -i pr12/chr6_aligned_sorted.bam > chr6.bed Конвертирует выровненные риды из .bam формата в .bed, записывает результат в файл chr6.bed.

/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools intersect -a /P/y14/term3/block4/SNP/rnaseq_reads/gencode.genes.bed -b chr6.bed -u > chr6.intersect Пересекает координаты выравниваний в файле chr6.bed с координатами разметки генов в файле gencode.genes.bed (причем разметка по генам именно в опции -а, потому что мы хотим увидеть, сколько ридов легло на каждый ген, а не на сколько генов откартировался каждый рид) и записывает в файл chr6.intersect названия генов, на которые откартировался хотя бы 1 рид (за счет опции -u). То есть просто убирает из файла gencode.genes.bed все гены, на которые не откартировались риды.

/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools intersect -a chr6.intersect -b chr6.bed -c > chr6_count.intersect Пересекает координаты генов, на которые откартировался хотя бы один рид, из файла chr6.intersect с координатами всех ридов из файла chr6.bed и опция -с считает, сколько ридов откартировалось на каждый фрагмент гена, результат записывает в chr6_count.intersect

Все риды откартировались на 2 белок-кодирующих гена: EEF1A1 из предыдущего практикума, на него откартировалось большинство ридов, и на ген MTO1, на который откартировался всего 1 рид. Наверное, это случайный рид, и отсеквенировать хотели транскрипты EEF1A1. Еще по одному риду откартировалось на гены miRNA AL603910.1, miscRNA Metazoa_SRP, antisense RP11-505P4.6, из которых последние два гена в Ensemble не нашлись.
Информация о генах:

ген EEF1A1 MTO1 AL603910.1

полное название eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 mitochondrial tRNA translation optimization 1 novel transcript

размер 8046 bp 47658 bp 370 bp

координаты 73,515,750-73,523,797 73,461,578-73,509,236 73,492,025-73,492,742

цепь reverse forward reverse

функция Фактор элонгации трансляции фактор оптимизации трансляции в митохондриях miRNA

количество экзонов в транскрипте ENST00000316292.13, на который откартировались все риды - 7 в транскрипте ENST00000498286.5 - 12

количество транскриптов 11 19 1

Дополнительные задания

Задание Команда Что делает

4. Объединить чтения в кластеры /P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools cluster -i chr6.bed > chr6_clusters.bed Команда кластеризует все риды и записывает результата в chr6_clusters.bed. Даже без параметра -d все риды объединяются в один кластер, то есть находятся очень близко.

5. Набрать из хромосомы 1000 случайных фрагментов по 200 нуклеотидов /P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools random -g chr6.genome -l 200 -n 1000 > chr6_random.bed Команда генерирует координаты 1000 случайных фрагментов 6 хромосомы длиной 200 bp и записывает их в файл chr6_random.bed

7. Получить координаты одного из покрытых чтениями генов, расширенные на 1000 нуклеотидов в обе стороны /P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools flank -b 1000 -i chr6.intersect -g chr6.genome > chr6_flank.bed Команда расширяет на 1000 bp в обе стороны координаты всех транскриптов, записанных в файле chr6.intersect (там только те, на которые откартировался хотя бы один рид). На рисунках изначальный транскрипт и тот же фланкированный транскрипт обведены в рамку.

До После

/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtobed -i pr12/chr6_aligned_sorted.bam > chr6.bed	Конвертирует выровненные риды из .bam формата в .bed, записывает результат в файл chr6.bed.
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools intersect -a /P/y14/term3/block4/SNP/rnaseq_reads/gencode.genes.bed -b chr6.bed -u > chr6.intersect	Пересекает координаты выравниваний в файле chr6.bed с координатами разметки генов в файле gencode.genes.bed (причем разметка по генам именно в опции -а, потому что мы хотим увидеть, сколько ридов легло на каждый ген, а не на сколько генов откартировался каждый рид) и записывает в файл chr6.intersect названия генов, на которые откартировался хотя бы 1 рид (за счет опции -u). То есть просто убирает из файла gencode.genes.bed все гены, на которые не откартировались риды.
/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools intersect -a chr6.intersect -b chr6.bed -c > chr6_count.intersect	Пересекает координаты генов, на которые откартировался хотя бы один рид, из файла chr6.intersect с координатами всех ридов из файла chr6.bed и опция -с считает, сколько ридов откартировалось на каждый фрагмент гена, результат записывает в chr6_count.intersect

ген	EEF1A1	MTO1	AL603910.1
полное название	eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1	mitochondrial tRNA translation optimization 1	novel transcript
размер	8046 bp	47658 bp	370 bp
координаты	73,515,750-73,523,797	73,461,578-73,509,236	73,492,025-73,492,742
цепь	reverse	forward	reverse
функция	Фактор элонгации трансляции	фактор оптимизации трансляции в митохондриях	miRNA
количество экзонов	в транскрипте ENST00000316292.13, на который откартировались все риды - 7	в транскрипте ENST00000498286.5 - 12
количество транскриптов	11	19	1

Задание	Команда	Что делает
4. Объединить чтения в кластеры	/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools cluster -i chr6.bed > chr6_clusters.bed	Команда кластеризует все риды и записывает результата в chr6_clusters.bed. Даже без параметра -d все риды объединяются в один кластер, то есть находятся очень близко.
5. Набрать из хромосомы 1000 случайных фрагментов по 200 нуклеотидов	/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools random -g chr6.genome -l 200 -n 1000 > chr6_random.bed	Команда генерирует координаты 1000 случайных фрагментов 6 хромосомы длиной 200 bp и записывает их в файл chr6_random.bed
7. Получить координаты одного из покрытых чтениями генов, расширенные на 1000 нуклеотидов в обе стороны	/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools flank -b 1000 -i chr6.intersect -g chr6.genome > chr6_flank.bed	Команда расширяет на 1000 bp в обе стороны координаты всех транскриптов, записанных в файле chr6.intersect (там только те, на которые откартировался хотя бы один рид). На рисунках изначальный транскрипт и тот же фланкированный транскрипт обведены в рамку.