Введение
Целью данного практикума было изучения влияния точечных мутаций на последовательность белка. С помощью пакета Emboss из генома Actinoplanes missouriensis была получена кодирующая последовательность ксилозоизомеразы типа А (координаты гена я взяла из практикума 6 первого семестра). Полученную последовательность я сравнила с последовательностью, которая была получена из NCBI в ходе того же практикума. Последовательности совпадали.
Затем, также с помощью пакета Emboss, нуклеотидная последовательность была транслирована в белковую с помощью команды transeq. Командой needle было выполнено выравнивание транслированной последовательности с последовательностью из практикума 6 (первый семестр). Впоследствии, все вносимые мутации были обработаны с помощью этих команд. Результатом является текстовый файл формата .needle, содержащий выравнивание, а так же информацию, связанную с процентами гэпов, схожестью и гомологичностью выравниваемых последовательностей.
Все мутации вводились в нуклеотидную последовательность вручную, затем были транслированы в белковую последовательность и выровнены. К предложенным одиннадцати мутациям я добавила еще пять.
Результаты
Из 16 осуществленных мутаций 2 оказались синонимическими, 8 — миссенс (от замены одной аминокислоты до замен последовательности из 6 аминокислот), а остальные 6 оказались нонсенсами (появление стоп-кодонов (от одного до нескольких) и полная замена последовательности в некоторых случаях)).
Таблица с описаниями всех проведенных мутаций
Для каждой мутации были построены выравнивания и получены изображения в формате .png, которые отображают различия выравниваний.
|
На картинке слева представлено изображение выравнивания последовательности, полученной после транслирования гена с мутацией типа нонсенс. Была сделана делеция 2 и 3 неклеотидов в последовательности, что привело к полной смене аминокислотного состава белка. Появилось как минимум 4 дополнительных стоп-кодона в последовательности. Такие изменения привели бы к полной потере свойств полипептида. На примере данного выравнивания можно разобрать его общую структуру: символ "*" обозначает стоп-кодон, символ "|" отражает полное совпадение аминокислот, точкой обозначаются аминокислоты, которые не совпадают по свойствам, а двумя же — аминокислоты, которые более-менее схожи (например, лизин-аргинин и валин-лейцин). Символом "-" обозначается гэп (пропуск аминокислоты). В колонке слева помещена информация о выравниваемых последовательностях, а в колонке справа — номера аминокислот. Итоговое выравнивание разбивается в блоки строчек, в каждом из которых находится ровно по 50 аминокислот. |
Снизу представлено изображение выравнивания последовательности, полученной из гена с мутацией типа миссенс.
Выводы
В ходе данной работы было обнаружено, что точечные мутации, связанные с заменой одного нуклеотида чаще всего приводят к синонимическим мутациями и мутациям типа миссенс. В редких случаях они могут приводить к появлению стоп-кодона в белковой цепи.
Вставка/делеция числа нуклеотидов кратных трем, приводит к выпаданию/появлению одной аминокислоты и мутации типа миссенс, что может приводить к различным последствиям: от ничего не значащей вставки на С-конце белка, которая не поменяет его свойств, до выпадения аминокислоты из активного центра и потерей функциональности белка. Также в последовательности может появиться стоп-кодон, что приведет к мутации типа нонсенс.
Наиболее же значительными мутациями являются вставка/делеция числа нуклеотидов, не кратного трем. В результате этого полностью меняется рамка считывания белка, что приводит к полной потере функциональности. Дополнительно появляются многочисленные стоп-кодоны.