Практикум 6. Сигналы и мотивы.

Сигнал транспозазы

attTn7 - нуклеотидная последовательность, которая распознается белком TnsD, который является частью бактериальной транспозазы Tn7. При узнавании происходит привлечении дополнительных белков комплекса, которые встраивают транспозон в upstream attTn7 сайта. Такие события происходят с достаточно высокой частотой. Сылка: Target Site Selection by Tn7: attTn7 Transcription and Target Activity

Построение PWM

import numpy as np
import requests
import pandas as pd
from scipy.stats import mannwhitneyu
from IPython.display import Image

genes_table = pd.read_csv("human-genes.tsv", sep="\t")
sequences = []
i = 0
req_count = 0
while req_count < 100:
    chromosome = genes_table.loc[i, "#chrom"]
    start = genes_table.loc[i, "thickStart"]
    strand = genes_table.loc[i, "strand"]
    i += 1
    if str(strand) == "+":
        link = f"https://rest.ensembl.org/sequence/region/human/{chromosome}:{start-6}..{start+400}:1?expand_3prime=0;expand_5prime=0"
        request = requests.get(link, headers={ "Content-Type" : "text/x-fasta"})
    else:
        continue
    if "error" in request.text:
        continue
    else:
        req_count += 1
        sequence = "".join(request.text.split("\n")[1:])
        sequences.append(sequence)
        
with open("sequences.txt", "w") as file:
    print(*sequences, sep="\n", file=file)
    

С использованием кода выше было отобрано 100 генов человека на + цепи для простоты, были взяты участки от -7 нуклкотида от координаты старт-кодона до +400 нуклеотида после. Ссылка на файл

sequences_clear=[]
sequences_test_negative=[]
with open("sequences.txt", "r") as file:
    sequences = file.readlines()
    for sequence in sequences:
        sequence_ = sequence[:13]
        if sequence_[7:10] == "ATG":
            sequences_clear.append(sequence_)
        ATG_coord_fake = sequence[200:].find("ATG")
        sequences_test_negative.append(sequence[200:][ATG_coord_fake-7:ATG_coord_fake+6])
sequences_train = sequences_clear[:40]
sequences_test = sequences_clear[40:]
sequences_test_negative = [seq for seq in sequences_test_negative if len(seq) == 13]
sequences_test_negative = sequences_test_negative[:36]

Далее были вырезаны участки размером 13 нуклеотидов в начале генов, из них были отобраны участки, содержащие старт кодон. Полученные последовательности были разделены на 40 для построения PWM, и 36 для теста. Негативный котроль был сформирован из участков вокруг кодонов AUG, удаленных минимум на 200 нуклеотидов от начала гена, таким образом не являющихся старт-кодонами.

class PWM():
    def __init__(self, e=1, freq=[0.298, 0.298, 0.202, 0.202]):
        self.e = e
        self.positions = {"A": 0, "T": 1, "G": 2, "C": 3}
        self.frequencies = np.array(freq).reshape((4, 1))
        
    def fit(self, seq_list):
        self.seq_arr = np.array(list(map(list, seq_list)), dtype="str")
        self.n_pos = len(seq_list[0])
        self.n_seq = len(seq_list)
        A_n = np.count_nonzero(self.seq_arr == "A", axis=0)
        T_n = np.count_nonzero(self.seq_arr == "T", axis=0)
        G_n = np.count_nonzero(self.seq_arr == "G", axis=0)
        C_n = np.count_nonzero(self.seq_arr == "C", axis=0)
        self.matrix = np.stack([A_n, T_n, G_n, C_n], axis=0).astype("float")
        pseudocount = self.e / 4
        self.matrix += pseudocount
        self.matrix = self.matrix / (self.n_seq+self.e)
        self.pwm_matrix = np.log(self.matrix / self.frequencies)
        
    def test(self, seq):
        weight = 0
        for i, nuc in enumerate(list(seq)):
            weight += self.pwm_matrix[self.positions[nuc], i]
        return weight
    
    def ic_calculate(self):
        self.ic_matrix = self.matrix * np.log2(self.matrix / self.frequencies)
        
    def return_pwm(self):
        return pd.DataFrame(self.pwm_matrix, columns = np.arange(1, self.n_pos + 1), index = ["A", "T", "G", "C"])
    
    def return_ic(self):
        return pd.DataFrame(self.ic_matrix, columns = np.arange(1, self.n_pos + 1), index = ["A", "T", "G", "C"])

PWM была реализована в виде класса с методами для построения PWM, вычисления весов тестовых последовательностей, вычисления матрицы информационного содержания и вывода матриц. Для вычисления базовых частот нуклеотидов был взят GC состав 40.4

pwm = PWM()
pwm.fit(sequences_train)
real_scores = []
fake_scores = []
for seq, fake_seq in zip(sequences_test, sequences_test_negative):
    real_scores.append(pwm.test(seq))
    fake_scores.append(pwm.test(fake_seq))
pwm.return_pwm()

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
A	-2.279767	-0.278287	-0.844682	-0.670329	-0.175633	-0.392697	-0.521909	1.192200	-3.889205	-3.889205	-0.670329	-0.278287	-1.691980
T	-0.392697	-0.521909	-1.324255	-1.324255	-1.691980	-0.844682	-1.055991	-3.889205	1.192200	-3.889205	-0.392697	-0.278287	-0.175633
G	0.733728	0.213193	0.610495	0.610495	0.894070	0.110539	-0.455856	-3.500379	-3.500379	1.581026	0.610495	0.213193	0.733728
C	0.542672	0.542672	0.733728	0.674008	-0.003871	0.790081	1.074332	-3.500379	-3.500379	-3.500379	0.306284	0.391441	0.306284

Матрица была построена на основании полученных ранее последовательностей и протестирована на положительном и отрицательном контроле, оба по 36 последовательностей. Ниже представлен результат непараметрического теста Манна-Уитни наборов полученных весов. Видно, что при уровне значимости 0.05, вес положительного контроля выше веса отрицательного.

print(f"Средний вес положительного контроля: {np.mean(real_scores)}, средний вес отрицательного контроля: {np.mean(fake_scores)}.")
print(mannwhitneyu(real_scores, fake_scores))

Средний вес положительного контроля: 5.708095784373053, средний вес отрицательного контроля: 4.762259673360172.
MannwhitneyuResult(statistic=485.0, pvalue=0.03361584398305171)

Матрица информационного содержания

pwm.ic_calculate()
pwm.return_ic()

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
A	-0.100275	-0.090578	-0.156043	-0.147421	-0.063346	-0.113999	-0.133145	1.688518	-0.034213	-0.034213	-0.147421	-0.090578	-0.133958
T	-0.113999	-0.133145	-0.151442	-0.151442	-0.133958	-0.156043	-0.157921	-0.034213	1.688518	-0.034213	-0.113999	-0.090578	-0.063346
G	0.445364	0.076893	0.327599	0.327599	0.637070	0.035979	-0.084213	-0.030793	-0.030793	2.239213	0.327599	0.076893	0.445364
C	0.272109	0.272109	0.445364	0.385398	-0.001124	0.507370	0.916729	-0.030793	-0.030793	-0.030793	0.121246	0.168730	0.121246

Выше представлена матрица информационного содержания для последовательностей, использованных для построения PWM. На рисунке ниже LOGO для этих последовательностей.

Image(filename="logo.png")