Занятие 9.

Традиционные ссылки на полезные ресурсы:

• Уроки по работе с Modeller находятся здесь.
  
• Напоминание о Python от Александра Гришина.
• Подсказки.

Вся работа по расчётам будет проходить на kodomo через терминал putty.

Цель данного занятия ознакомится с возможностями гомологичного моделирования комплекса белка с лигандом.
В этом занятии мы будем пользоваться пакетом Modeller. Это программное обеспечение распространяется бесплатно для академических пользователей.

Вы будете работать с белком лизоцимом из указанного организма. Используя известную структуру лизоцима форели как образец, Вам необходимо построить модель комплекса Вашего белка с лигандом.

Программе MODELLER для моделирования структуры белков, в качестве входных данных нужны: управляющий скрипт, файл pdb со структурой-образцом, файл выравнивания с дополнительной информацией.

1. Постройте выравнивание последовательности из структуры ID: 1lmp и предложенного Вам белка. Рекомендуемые ресурсы и программы: Clustal и GeneDoc Полученное выравнивание сохраните в формате PIR.

2. Модификация файла выравнивания:
   Переименуйте последовательность в файле выравнивания как в примере:

   Было	Стало
   >P1;uniprot|P37712|LYSC_CAMDR	>P1;seq
   >P1;1LMP__|PDBID|CHAIN|SEQUENCE	>P1;1lmp

   После имени последовательности моделируемого белка добавьте строчку:

   sequence:ХХХХХ::::::: 0.00: 0.00

   эта строчка описывает входные параметры последовательности для modeller.
   После имени последовательности белка-образца добавьте:

   structureX:1lmp_now.ent:1 :A: 132 :A:undefined:undefined:-1.00:-1.00

   эта строчка описывает, какой файл содержит структуру белка с этой последовательностью, номера первой и последней аминокислот в структуре, идентификатор цепи и т.д. В конце каждой последовательности добавьте символы

   /.

   Символ "/" означает конец цепи белка. Точка указывает на то, что имеется один лиганд (если бы было два лиганда стояли бы две точки).

3. Модификация файла со структурой: удалите всю воду из структуры (в текстовом редакторе) всем атомам лиганда присвойте один и тот же номер "остатка" (MODELLER считает, что один лиганд = один остаток) и модифицируйте имена атомов каждого остатка, добавив в конец буквы A, B, C. Смысл операции в том, что атомы остатка 130 имели индекс А, атомы остатка 131 имели индекс В и т.д. . После модификации имен атомов измените номера остатков на 130.
   Пример:

   Было	Стало
   HETATM 1014 O7 NAG 130	HETATM 1014 O7A NAG 130
   HETATM 1015 C1 NAG 131	HETATM 1015 C1B NAG 130

   сохраните в файле 1lmp_now.ent

4. Создание управляющего скрипта my_seq.py (my_seq - имя Вашей последовательности, например, lysc_chram)
   Вам представляется следующая заготовка:

   from modeller.automodel import *
   class mymodel(automodel):
       def special_restraints(self, aln):
           rsr = self.restraints
           for ids in (('OD1:98:A', 'O6A:131:A'),
                       ('N:65:A', 'O7B:132:A'),
                       ('OD2:73:A', 'O1C:133:A')):
                       atoms = [self.atoms[i] for i in ids]
                       rsr.add(forms.upper_bound(group=physical.upper_distance,
                         feature=features.distance(*atoms), mean=3.5, stdev=0.1)) 
   env = environ()
   env.io.hetatm = True
   a = mymodel(env, alnfile='test1.ali', knowns=('1lmp'), sequence='seq')
   a.starting_model = 1
   a.ending_model = 5
   a.make()
   

   В скрипте указано:
   
   • что нужно использовать стандартные валентные углы в полипептидной цепи (строчка 4)
     что дополнительно нужно сохранять взаимное расположение определенных пар атомов (3.5 ангстрема);
     В данном случае трех атомов белка, образующих водородные связи с тремя атомами лиганда - строчки 5-7 с ID пар атомов; параметры взаимного расположения атомов пары описаны в строчке 9-10. 3 точки могут однозначно расположить сложную структуру в пространстве, поэтому мы выбираем водородные связи как источник данных точек.
     
   • что ковалентные связи в гетероатомах нужно вычислять по расстояниям между атомами (так же, как это делает Rasmol), строчка 12
     
   • что имя файла с выравниванием и имена последовательностей образца и моделируемого белка, строчка 13 (а имя файла со структурой содержится в выравнивании)
     
   • что число и номера моделей, которые нужно построить (в данном примере 5 моделей), строки 14-15
     
   • что пора строить модель строчка 16
     

   В скрипте Вам необходимо отредактировать строчки, в которых указаны какие водородные связи белка с лигандом должны быть В БУДУЩЕЙ МОДЕЛИ. Номера остатков и имена нужных атомов определите по выравниванию и тому, какие водородные связи имеются в образце. Критерий водородной связи: расстояние менее 3.5 ангстрем между азотом или кислородом белка с подходящими атомами лиганда.
   Если в моделируемом белке число остатков не совпадает с числом остатков в белке-образце, то номера "остатков" лиганда изменятся.
   

   ВНИМАНИЕ. В скриптовом языке (на основе python ) важно с какого столбца начинается информация. Соблюдайте предложенный в заготовке синтаксис.
   

5. Запустите исполнение скрипта командой

    mod9v7 myscript & 

6. Просмотрите полученные Вами модели.

7. Проверьте качество моделей и выберите лучшую. Инструменты для оценки качества структуры можно найти в веб интерфейсе WHATIF. Достаточно 2-3 инструментов. Выберете лучшую модель.

8. Подсказки.

   • Последовательность из pdb файла удобно найти, используя сайт банка PDB.
   • Программе ClustalW сразу укажите формат выравнивания PIR.
   • Для поиска контактирующих атомов используйте RASMOL/PyMol. Напоминаем синтаксис: select within( 3. , NAG) and not HOH
   • Для поиска номеров остатков, которые будут контактировать с лигандом в Вашей модели можно воспользоваться GeneDoc.
   • Для выполнения команды моделирования зайдите на kodomo с помощью putty. Все входные файлы для моделирования сохраните в Unix-формате с помощью FAR (Shift+F3)