Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями.

1. Поиск в геноме участков, кодирующих белки, похожие на заданный.


Задача: найти в геноме Geobacillus thermodenitrificans последовательности, кодирующие похожие на белок RESA из Bacillus subtilis.

Для решения задачи выбираю из пакета BLAST+ программу tbblastn (запрос - белок, база данных - нуклеотидные последовательности).

С помощью команды makeblastdb создаю три файла базы данных по геному данной бактерии.

На всякий случай создаю файл-справку по команде. Интересующие возможности: 

** Input options
 -in 
   Input file/database name; the data type is automatically detected, it may
   be any of the following:
        FASTA file(s) and/or
        BLAST database(s)
   Default = `-'
 -dbtype 
   Molecule type of input
   Default = `prot'

** Output options
 -out 
   Name of BLAST database to be created
   Default = input file name provided to -in argumentRequired if multiple
   file(s)/database(s) are provided as input

Выполняю команду, получаю три файла: gt.nhr, gt.nin и gt.nsq (не прилагаю к работе, так как файлы бинарные и не читаются "глазами"):

makeblastdb -in gt_genome.fasta -out gt -dbtype nucl

Теперь читаю информацию о выбранной программе tblastn (tblastn_help.txt): 

 *** Input query options
 -query 
   Input file name
   Default = `-'

 *** General search options
 -db 
   BLAST database name
 -out 
   Output file name
   Default = `-'
 -evalue 
   Expectation value (E) threshold for saving hits 
   Default = `10'

Предварительно получаю последовательность RESA_BACSU, хотя её можно взять со страницы прошлого семестра (resa.fasta): 

seqret sw:resa_bacsu resa.fasta

Выполняю команду и получаю файлы: 

tblastn -query resa.fasta -db gt -evalue 0.001 -out tblastn.txt

Получаю файл: tblastn.txt

Число находок с E-value < 0,001

 1
E-value лучшей находки 9e-08
Название последовательности с лучшей находкой CP000557 CP000557.1 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, complete genome. (Bacterioferritin comigratory protein - из описания генома)
Координаты лучшей находки (от-до) от 544245 до 544550
Доля последовательности вашего белка, вошедшая в выравнивание с лучшей находкой (137-36+1)/179 = 0.569

Выравнивание:

> CP000557 CP000557.1 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, complete 
genome.
Length=729146

 Score = 48.1 bits (113),  Expect = 9e-08, Method: Compositional matrix adjust.
 Identities = 32/104 (31%), Positives = 51/104 (50%), Gaps = 4/104 (3%)
 Frame = +3

Query  36      ISEGSDAPNFVLEDTNGKRIELSDLKGKGVFLNFWGTWCEP-CKKEFPYMANQYKHFKSQ  94
               I+ G  AP+F L  +NGK + LSD +G+ V L F+     P C  E     ++Y+ F   
Sbjct  544245  IAIGQPAPDFTLPASNGKMVSLSDFRGQYVVLYFYPKDMTPGCTTEACDFRDRYEQFT--  544418

Query  95      GVEIVAVNVGESKIAVH-NFMKSYGVNFPVVLDTDRQVLDAYDV  137
               G+  V + V    +  H  F++ Y + F ++ D    V + Y V
Sbjct  544419  GLNAVILGVSTDPVKRHETFIEKYQLPFLLLSDEQHHVAELYGV  544550

Фрагмент из описания генома, перекрывающийся с находкой:

544239..544715
/codon_start=1
/transl_table=11
/locus_tag="GTNG_0489"
/product="Bacterioferritin comigratory protein"
/db_xref="GOA:A4IKL7"
/db_xref="InterPro:IPR000866"
/db_xref="InterPro:IPR012336"
/db_xref="InterPro:IPR024706"
/db_xref="UniProtKB/TrEMBL:A4IKL7"
/protein_id="ABO65871.1"
/translation="MIIAIGQPAPDFTLPASNGKMVSLSDFRGQYVVLYFYPKDMTPGC
TTEACDFRDRYEQFTGLNAVILGVSTDPVKRHETFIEKYQLPFLLLSDEQHHVAELYGV
WKKKRNFGKEYMGIERSTFIIAPDGTLVKEWRGVKVKGHVDEALAEVAQLASSR"

2. Нахождение записи EMBL по последовательности программой BLASTN.


Из заданной директории с kodomo скачала файл с последовательностью нуклеотидов. Задача: получить информацию об этой последовательности, используя BLASTN на EBI.

Последовательность действий.
Захожу на сайт http://www.ebi.ac.uk/. 

Меню Tools -> Similarity&Homology -> NCBI BLAST
Ссылка Nucleotide Databases

Снятие галочки напротив EMBL Release
Треугольник EMBL Release  
Треугольник EMBL Prokaryote
Галочка напротив EMBL Standard Prokaryote

Данная последовательность и вид окна результатов с показанными последовательностями: 

ttccggggtatcgtacccgtcgaccgtctaccttcgcttcctgacccgcaggcaatccag
ttctggatgggtaaaaacgctcacatgctccattacgcgattgggcgtgacggcgacgcg
gtcaatttcttcgctgttgttgagggacctcaaccctggttggacgagacccgctgggtg

Полностью идентичных находок - шесть. Все находки - ген салицилат гидроксилазы из разных штаммов Sphingomonas xenophaga. 

Таксономия Sphingomonas xenophaga: 

Bacteria 
Proteobacteria 
Alphaproteobacteria 
Sphingomonadales 
Sphingomonadaceae 
Sphingobium

Результат (общее название записей "Sphingomonas xenophaga gene for salicylate hydroxylase, complete cds"):

EM_PRO Штамм Начало Конец Соответствие цепей ДНК Описание в FT Направление белка
AB099984 P2 662 841 комплементарное salicylate hydroxylase P96555 прямое
AB099983 P1 662 841 комплементарное salicylate hydroxylase P96556 прямое
AB099982 AJ8 662 841 комплементарное salicylate hydroxylase P96557 прямое
AB099981 AJ6 662 841 комплементарное salicylate hydroxylase P96558 прямое
AB099980 TB4 662 841 комплементарное salicylate hydroxylase P96559 прямое
AB000564 - 917 1096 комплементарное salicylate hydroxylase P96560 прямое

3. Поиск гомологов гена программой BLASTN.


Через ссылку на запись EMBL в файле последовательности белка RESA_BACSU нашла координаты гена этого белка в полном геноме Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (запись AL009126, участок complement(2420804..2421343)). Вырезала с помощью seqret c опцией -sask. Произвела поиск гомологов с помощью BLASTN.
Получила, что программма не находит никаких гомологов. Выходной файл: file.txt

Поиск по гену в геноме - гораздо более строгий, чем поиск по белковому запросу. Причина - меньшая консервативность последовательности ДНК по сравнению с белком, не учитывается значимость сходства отдельных триплетов. Таким образом, поиском Query ДНК по геномной базе данных гораздо имеет большую точность, но меньшую чувствительность.
При изменении длины слова находки начинают появляться.

Главная страница
Страница семестра
© Галицына Александра, 2012