Исследование ДНК-белковых взаимодействий в структуре комплекса DNA LIGASE I и 3 цепей ДНК

  1. Краткое описание структуры в файле 1X9N.pdb

    2. В файле 1X9N.pdb приведены координаты атомов следующих молекул:
    1. DNA LIGASE I (POLYDEOXYRIBONUCLEOTIDE SYNTHASE [ATP]) - ДНК-лигаза I (АТФ-зависимая полидезоксирибонуклеотид-синтетаза) - 1 цепь (А);
    2. DIDEOXY TERMINATED DNA (дидезокси- на последнем нуклеотиде ДНК) - 1 цепь (B);
    3. 5'-PHOSPHORYLATED DNA (фосфорилированная на 5' конце ДНК) - 1 цепь (C);
    4. TEMPLATE DNA (ДНК-матрица) - 1 цепь (D);
    5. ADENOSINE MONOPHOSPHATE (AMP) - аденозин-монофосфат - 1 молекула;
    6. SELENOMETHIONINE (селенометионин C5H11NO2Se) - 6 молекул.
    Эти молекулы были получены из организма HOMO SAPIENS (человек разумный).

    Для исследования были выбраны цепь А белка и цепи В, С и D, представляющие собой ДНК со следующей последовательностью:

        цепь В   [3] 5' - GCTGATGCGT DOC - 3' [13], цепь С  [1] 5' - GTCGGACTG  - 3' [9]
                      ||||||||||  |                              |||||||||
    цепь D  [26] 3' - CGACTACGCA  G  - 5' [16], цепь D [15] 3' - CAGCCTGAC  - 5' [7],

    где 3-13, 1-9 и 7-26 - номера первых и последних нуклеотидов, а DOC - 2',3'-дидезоксицитидин-5'-монофосфат.
    Для упрощения работы с ДНК был создан отдельный файл только с координатами нуклеиновой кислоты (без координат белка): 1x9n_d.pdb.

  2. Функции белка, структура которого представлена в файле 1X9N.pdb

    3. Для определения функции белка, образующего комплекс с ДНК, я использовал базу данных UniProtKB. Там я смог найти описание белка DNA ligase I. Основная функция фермента - зашивание щелей в двухцепочечной ДНК во время репликации, рекомбинации и починки ДНК. Используя энергию АТФ, фермент сшивает между собой дезоксирибонуклеотиды, используя в качестве кофактора атом магния. Выполняет он свои функции, разумеется, в ядре, принадлежит к семейству АТФ-зависимых ДНК-лигаз.

  3. Исследование структуры ДНК

    4. Прежде всего с помощью программ find_pair и analyze я получил выходной файл 1x9n_d_old.out. Согасно данным одной из таблиц файла изучаемая ДНК представляет собой B-форму.
    Затем я импортировал содержащиеся в выходном файле значения торсионных углов в Excel и рассчитал среднее значение каждого угла, чтобы затем посчитать отклонение каждого нуклеотида от среднего значения и выявить самые "кривые" нуклеотиды. Найдя для каждого торсионного угла среднее значение, я просуммировал модули отклонений углов от средних значений для каждого нуклеотида. Для цепей В и С средние значения я считал вместе, ведь, по сути, они друг друга дополняют. Тем более, так было удобнее посмотреть, будет ли наблюдаться "кривизна" для комплементарного нуклеотида в цепи D, если она проявится у нуклеотида в цепи С или В. Нуклеотиды, суммы отклонений углов которых превзошли 600, я покрасил красным цветом, а те, суммы углов которых превзошли 500 - оранжевым. Я немного удивился, когда увидел, что в результате в получившейся таблице гипотеза о "кривизне" нуклеотида при условии "кривизны" комплементарного ему подтвердилась всего два раза (в случае 12-го и 14-го нуклеотидов). В остальных же случаях напротив "кривого" нуклеотида располагался вполне нормальный, не сильно "деформированный", но зато его сосед зачастую оказывался "кривым". Я думаю, что это можно объяснить тем, что засчет спиральной конформации ДНК при "деформации" в одной из цепей одного нуклеотида нуклеотиду другой цепи, расположенному рядом с комплементарным, приходится также "деформироваться", чтобы комплементарный сосед смог пространственно "подстроиться" под своего "кривого" напарника. Таким образом, если мы рассматриваем 2 цепи, зачастую "деформации" чередуются для большей стабильности молекулы (если в одном и том же месте двух цепей будут располагаться "деформированные" комплементарные нуклеотиды, молекула будет менее стабильна, чем если они будут располагаться по очереди).

  4. Исследование природы ДНК-белковых контактов

    5. Полярными считались атомы кислорода и азота, а неполярными - атомы углерода, фосфора и серы. Полярным контактом считалась ситуация, в которой расстояние между полярным атомом белка и полярным атомом ДНК меньше 3.5Å. Аналогично, неполярным контактом считалась пара неполярных атомов на расстоянии меньше 4.5Å.
    С помощью скрипта my_dna.def было подсчитано количество различных контактов между белком и нуклеиновой кислотой в изучаемом комплексе. Результат представлен в таблице:

    Таблица. Контакты разного типа в комплексе 1X9N.pdb

    Контакты атомов белка с Полярные Неполярные Всего
          остатками 2'-дезоксирибозы 13 74 87
          остатками фосфорной кислоты 40 54 94
          остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки 0 0 0
          остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки 3 3 6

    После изучения пространственной ориентации комплекса в программе RasMol результаты, приведенные в таблице, оказались вполне ожидаемыми. Действительно, белок окружает цепи ДНК, в основном, именно с краев, взаимодействуя таким образом с сахарофосфатным остовом, не погружаясь в пространство бороздок. Самые близкие контакты фермент образует с остатками фосфорной кислоты, это очень хорошо видно из рисунка, представленного ниже. Конечно, гидрофобных взаимодействий белок и ДНК образуют больше, чем полярных связей, что связано прежде всего с большим количеством гиброфобных атомов (прежде всего атомов углерода) по сравнению с полярными атомами (кислорода и азота). Впрочем, стоит заметить, что полярных контактов белка с остатками фосфорной кислоты почти столько же, сколько неполярных. Это объясняется, как раз, близким расположением цепи белка и атомов кислорода при фосфате.

    Рис.1. Пространственная ориентация ДНК-белкового комплекса

  5. Получение популярной схемы ДНК-белковых контактов с помощью nucplot

    6. C помощью программы nucplot получил схему ДНК-белковых контактов:


    Рис.2. Схема ДНК-белковых контактов

    Как видно из схемы, белок и ДНК образуют много контактов. Причем, как я уже заметил в прошлом пункте, основное число контактов со стороны нуклеиновой кислоты образуют остатки фосфорной кислоты, чуть меньше - атомы дезоксирибозы, а атомы азотистых оснований, исходя из схемы, образуют всего один контакт с атомами белка (контакт между DТ10 и NH2-группой Arg305. Может показаться, что контакт образует еще азотистое основание DG16, но это взаимодействие не с белком, а с 13-м нулеотидом B-цепи ДНК, который в схему не попал (он не связан с 12-м нуклеотидом в pdb-файле)).
    Остатки фосфорной кислоты, как видно, в большинстве своем контактируют с атомами азота белка, что есть образуют полярные взаимодействия (с помощью расположенных при фосфоре атомов кислорода). Дезоксирибоза же, напротив, образует с аминокислотными остатками почти только гидрофобные взаимодействия.
    Кстати, интересно заметить, что для цепей В и С, в основном, наблюдается отсутствие контактов с белком "кривых" нуклеотидов (хотя, безусловно, есть исключения), а для цепи D, наоборот, все имеющиеся там "кривые" нуклеотиды связаны не одним, а сразу несколькими контактами с аминокислотными остатками (включая единственный нуклеотид DT10, образующий контакт азотистым основанием). Это говорит о том, что взаимодействию с белком подвергается, скорее всего, в основном, цепь D ДНК, в связи с чем и появляется пространственная "деформация" нуклеотидов.

    В качестве аминокислотного остатка, образующего больше всего контактов с ДНК, я выбрал Lys770. Вообще максимальное число взаимодействий аминокислотного остатка с ДНК в изучаемом комплексе - 2. Я выбрал остаток Lys770, потому что он единственный образует две полярные связи (одну с атомом кислорода фосфатного остатка, а вторую с 4' атомом кислорода дезоксирибозы). Ниже представлено изображение этого взаимодействия:

    Рис.3. Взаимодействие Lys770 и DG14

  6. Возможные распознающие контакты

    7. Выбирать кандидата на роль распознающего контакта мне было, вообще-то говоря, не из кого. Такой вариант в изучаемом комплексе может быть только один. Это взаимодействие между азотистым основанием нуклеотида DТ10 и радикалом аминокислотного остатка Arg305. Больше ни одно азотистое основание нуклеиновой кислоты не образует с белком контакта, а ведь только расположение азотистых оснований отличает одну ДНК от другой. Поэтому остается предположить, что это и есть единственный возможный распознающий контакт. NH2-группа аргининового радикала взаимодействует со 2 атомом кислорода тимина (DТ10). Ниже представлено изображение этого взаимодействия:

    Рис.4. Взаимодействие Arg305 и DТ10

  7. Характеристика ДНК-связывающего домена белка P18858

    8. C помощью Pfam мной была получена доменная структура белка DNL1_HUMAN, образующего комплекс с ДНК:

    Source Domain Start End
    PfamB Pfam-B_22419 1 131
    PfamB Pfam-B_44457 133 261
    PfamA DNA_ligase_A_N 287 465
    PfamA DNA_ligase_A_M 542 746
    PfamA DNA_ligase_A_C 771 836

    Среди представленных доменов ДНК-связывающий - DNA_ligase_A_N. Его полное название - DNA ligase N terminus.

    Этот домен можно обнаружить не во всех АТФ-зависимых ДНК-лигазах (EC:6.5.1.1). Вероятно, он участвует в связывании с ДНК и в катализе. В человеческой ДНК лигазе I (P18858) и в Saccharomyces cerevisiae (P04819) этот домен необходим для катализа, в то время как в Vaccinia virus (P16272) этот домен для него не существенен. Но делеция этого участка уменьшает сродство к разрезанной ДНК и уменьшает скорость присоединения цепи на стадии, следующей за формированием фермент-аденилата.

Назад