Практикум 14: сборка de novo хлоропластных чтений

Образец и получение данных

Код доступа: SRR1724088 (проект секвенирования РНК из хлоропластов Arabidopsis thaliana). Чтения одиночные, длина 101 п.н., технология Illumina. Данные скачаны с ENA:

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR172/008/SRR1724088/SRR1724088.fastq.gz

Размер архива: 733 МБ.

Подготовка чтений (Trimmomatic)

Для удаления адаптеров создан общий файл адаптеров:

cat /mnt/scratch/NGS/adapters/* > adapters.fasta

Этап 1 – удаление адаптеров (SE):

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE \

SRR1724088.fastq.gz \

step1_trimmed.fastq.gz \

-trimlog trimlog_step1.txt \

ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7

Результат: Input Reads: 12 136 372, Surviving: 12 125 804 (99,91%), Dropped: 10 568 (0,09%).

Этап 2 – обрезка по качеству и фильтрация по длине:

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE \

step1_trimmed.fastq.gz \

final_trimmed.fastq.gz \

-trimlog trimlog_step2.txt \

TRAILING:20 MINLEN:32

Результат: Input Reads: 12 125 804, Surviving: 11 716 584 (96,63%), Dropped: 409 220 (3,37%).

Размеры файлов после каждого этапа:

• SRR1724088.fastq.gz – 733 МБ
• step1_trimmed.fastq.gz – 717 МБ
• final_trimmed.fastq.gz – 690 МБ

Сборка контигов (Velvet, k=31)

Построение k-меров:

velveth assembly_dir 31 -fastq -short final_trimmed.fastq.gz &> velveth.log

Сборка графа:

velvetg assembly_dir &> velvetg.log

Статистика сборки:

• N50 = 29 (половина всех собранных нуклеотидов находится в контигах длиной ≤29 п.н.)
• Три самых длинных контига (по данным stats.txt и фактическим последовательностям):
  • Контиг 49377: длина 1618 п.н. (по .fa), покрытие 25,79
  • Контиг 43390: длина 1060 п.н., покрытие 14,32
  • Контиг 22365: длина 918 п.н., покрытие 11,20
• Контиги с аномально высоким покрытием (в тысячи раз выше среднего 17,1):

  350     1       185     121     0.000000        1566165.000000  ...

  336     1       68      74      0.000000        1560283.000000  ...

  Это однонуклеотидные контиги, вероятно, артефакты сборки.
• Контиги с аномально низким покрытием (Inf, т.е. близким к нулю) – также артефакты.

BLAST-анализ трёх самых длинных контигов

Для каждого контига выполнено выравнивание с референсными геномами A. thaliana (режим align two sequences или обычный BLAST с ограничением таксона).

Контиг NODE_49377 (1618 п.н., покрытие 25,8)

Выравнивание на хлоропластный геном NC_000932.1:

• Координаты на референсе: 25799 – 27416 (прямая цепь)
• Длина выравнивания: 1618 п.н. (100% контига)
• Идентичность: 99,88% (1616 совпадений, 2 замены, гэпов нет)
• E-value: 0.0
• Участок соответствует гену psbA (D1 белок фотосистемы II) – типичный хлоропластный ген.

Контиг NODE_43390 (1060 п.н., покрытие 14,3)

С хлоропластным геномом совпадений не найдено, но обнаружено высокое сходство с митохондриальным геномом NC_001284.2:

• Координаты: 302149 – 303208 (обратная цепь)
• Длина выравнивания: 1060 п.н. (100% контига)
• Идентичность: 99,43% (1054 совпадения, 6 замен, гэпов нет)
• E-value: 0.0
• Участок соответствует гену nad5 (субъединица 5 NADH-дегидрогеназы митохондрий).