Пракикум 6: Секвенирование по Сэнгеру

Рисунок 1 — Хроматограмма, общий вид

Вводные по выполнению работы

  • Файл хроматограммы: 15_F.ab1
  • Программа для анализа: UGENE
  • Обозначения: для гетерозиготных позиций использовались символы IUPAC
  • Метод анализа: «на глаз» (визуальная оценка качества сигнала)

Результаты

1. Общие параметры хроматограммы

  • Общая длина последовательности: 716 нуклеотидов
  • Качество секвенирования: хорошее

2. Трудночитаемые участки на концах

Как и ожидалось для метода Сэнгера, начальный и конечный участки имеют низкое качество:

  • Позиции 1-100: высокий фон (Рис. 2)
  • Позиции 611-716: сжатие пиков, наложения (Рис. 3)
Рисунок 2 — Начальный трудночитаемый участок (позиции 1-100)

Рисунок 3 — Конечный трудночитаемый участок (позиции 611-716)

3. Оценка уровня шума

  • Общая характеристика: Уровень шума низкий на протяжении всей хроматограммы.
  • Локальные проблемы: есть отдельные участки со сбоями (например, позиции 198-200, рис. 4)
Рисунок 4 — Пример локальной проблемы – «сбоя», позиции 198-200

Примеры разных ситуаций:

  • Минимальный шум (376-395): Четкие разделенные пики (Рис. 5)
  • Шум не мешает интерпретации (244-251): Фон присутствует, но не затрудняет чтение (Рис. 6)
  • Шум мешает интерпретации (316-322, 369-374): Скачки фона искажают сигнал (Рис. 7 и рис. 8)

Рисунок 5 — Участок с минимальным шумом
Рисунок 6 — Шум есть, но не мешает чтению
Рисунок 7 — Участки, где шум мешает интерпретации, позиции 315-324
Рисунок 8 — Участки, где шум мешает интерпретации, позиции 368-374

4. Выявленные полиморфизмы

В ходе анализа было идентифицировано 6 позиций, где автоматическое определение нуклеотида является ошибочным или неоднозначным. Все они представляют собой случаи гетерозиготных полиморфизмов, когда на одной и той же позиции присутствуют два разных нуклеотида.

Обозначения нуклеотидов согласно стандарту IUPAC – см. таблица 1, источник: www.hgmd.cf.ac.uk/docs/nuc_lett.html

  • Позиция 160: Два пика равной высоты
  • A и T → W (Рис. 9)
Рисунок 9 — Полиморфизм A/T (W) в позиции 160
  • Позиция 305: Два пика равной высоты
  • T и G → K (Рис. 10)
Рисунок 10 — Полиморфизм T/G (K) в позиции 305
  • Позиция 327: Два пика равной высоты
  • T и G → K (Рис. 11)
Рисунок 11 — Полиморфизм T/G (K) в позиции 327
  • Позиция 448: Два пика равной высоты
  • C и G → S (Рис. 12)
Рисунок 12 — Полиморфизм C/G (S) в позиции 448
  • Позиция 465: Два пика равной высоты
  • T и G → K (Рис. 13)
Рисунок 13 — Полиморфизм T/G (K) в позиции 465
  • Позиция 480: Два пика равной высоты
  • C и A → M (Рис. 14)
Рисунок 14 — Полиморфизм C/A (M) в позиции 480
Таблица 1. Nucleotide symbols, источник: www.hgmd.cf.ac.uk/docs/nuc_lett.html
Nucleotide symbol Full Name
A Adenine
C Cytosine
G Guanine
T Thymine
U Uracil
R Guanine / Adenine (purine)
Y Cytosine / Thymine (pyrimidine)
K Guanine / Thymine
M Adenine / Cytosine
S Guanine / Cytosine
W Adenine / Thymine
B Guanine / Thymine / Cytosine
D Guanine / Adenine / Thymine
H Adenine / Cytosine / Thymine
V Guanine / Cytosine / Adenine
N Adenine / Guanine / Cytosine / Thymine

Итоги

Хроматограмма 15_F.ab1 демонстрирует высокое качество секвенирования. Выявлены характерные для метода Сэнгера проблемы на концах последовательности и несколько гетерозиготных позиций в середине. Все неоднозначности успешно разрешены с помощью символов расширенного алфавита IUPAC, что обеспечивает корректное представление генетической последовательности.

Placeholder

Практикум 3

Комплексы ДНК-белок

Тык

Placeholder

Практикум 7

Нуклеотидные банки данных

Тык

Placeholder

Практикум 8

Нуклеотидный BLAST

Тык