Практикум 4

Предсказание вторичной структуры заданной тРНК и анализ НК-белкового комплекса

Автор старался, но не может гарантировать отсутствие биологических ошибок.

Задание 1. Предсказание вторичной структуры заданной тРНК

Сравнивались результаты разных программ по предсказанию вторичной структуры РНК. Общие результаты представлены в таблице 1. Описание, полученное find_pair, можно найти в прошлом практикуме. Программа einverted использовалась по команде (данные параметры показались наиболее оптимальными):

einverted -sequence 1FFY -gap 12 -threshold 10 -match 3 -mismatch -3  -outfile outfile -outseq seqout

где 1FFY - fasta-файл с последовательность исследуемой тРНК (результат выдачи - seqout). Для получения результатов предсказания по алгоритму Зукера использовалась web-версия - RNAfold. Визуальное представление результатов при энергетических параметрах по Andronescu model, 2007 на рисунке 1.
По результатам видно, что точность предсказания вторичной структуры поиском инвертированных повторов уступает точности по алгоритму Зукера.

RNAfold result — **Рисунок 1.** Визуальное представление результата MFE fold выдачи алгоритма Зукера для 1FFY. Окраска нуклеотидов по их структурной принадлежности.

**Таблица 1.** Реальная и предсказанная вторичная структура тРНК из файла 1FFY.pdb.
Участок структуры	Позиции в структуре (по результатам find_pair)	Результаты предсказания с помощью einverted	Результаты предсказания по алгоритму Зукера
Акцепторный стебель	1-7 : 72-66	1-7	1-7 : 73-67
D-стебель	10-13 : 25-22	23-32	10-13: 26-23
T-стебель	49-53 : 65-61	57-63	50-54 : 66-62
Антикодоновый стебель	38-44 : 32-26	40-49	28-32 : 44-40
Общее число канонических пар нуклеотидов	23 пары	34 пары	21 пара

Задание 2. Поиск ДНК-белковых контактов в заданной структуре

Упражнение 1

Скрипт, задающий для 1r4o множество атомов кислорода 2'-дезоксирибозы (set1), атомов кислорода в остатке фосфорной кислоты (set2), атомов азота в азотистых основаниях (set3) в PyMol и позволяющий получить рисунки 2-6. Создайте скрипт-файл, вызов которого в JMol даст последовательное (с паузами!) изображение всей структуры, только ДНК в проволочной модели, той же модели, но с выделенными шариками множеством атомов set1, затем set2 и set3.

1r4o full — **Рисунок 2.** Cartoon изображение структуры 1r4o.

dna 1r4o — **Рисунок 3.** Изображение только ДНК в проволочной модели.

1r4o dna, set1 — **Рисунок 4.** Изображение только ДНК в проволочной модели с выделенным шариками множеством атомов set1.

1r4o dna, set2 — **Рисунок 5.** Изображение только ДНК в проволочной модели с выделенным шариками множеством атомов set2.

1r4o dna, set3 — **Рисунок 6.** Изображение только ДНК в проволочной модели с выделенным шариками множеством атомов set3.

Упражнение 2

Далее идет описание ДНК-белковых контактов в структуре 1r4o. Будем считать полярными атомы кислорода и азота, а неполярными атомы углерода, фосфора и серы. Назовем полярным контактом ситуацию, в которой расстояние между полярным атомом белка и полярным атомом ДНК меньше 3.5Å. Аналогично, неполярным контактом будем считать пару неполярных атомов на расстоянии меньше 4.5Å.
Команды Pymol, помогающие выполнить задание.

**Таблица 2.** Контакты разного типа в комплексе 1r4o.pdb.
Контакты атомов белка с...	Полярные	Неполярные	Всего
остатками 2'-дезоксирибозы	1	20	21
остатками фосфорной кислоты	13	16	29
остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	4	9	13
остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	0	1	1

Таблица 2 содержит результаты исследования. Заметно преобладание неполярных контактов над полярными, которое можно объяснить высокой встречаемостью углеродов как в аминокислотах, так и в нуклеиновых кислотах. Остатки сахара и фосфорных кислот находятся на внешней стороне ДНК, поэтому белок чаще связывается с атомами, принадлежащими этим структурам. Если и происходит контакт атомов аминокислот с азотистыми основаниями, то у белка из стерических соображений больше шансов "проникнуть" в большую борозду ДНК, чем в малую.

Упражнения 3-4

Для получения популярной схемы ДНК-белковых контактов с помощью программы nucplot были выполнены следующие команды:

wget "https://files.rcsb.org/download/1r4o.pdb" -O "1R4O.pdb"

remediator --old 1r4o.pdb > 1r4o_old.pdb

nucplot 1r4o_old.pdb

Далее файл nucplot.ps был преобразован в nucplot.pdf, содержащий желаемую схему. На ней помимо ДНК-белковых контактов представлены контакты ДНК с молекулами воды, потому что pdb файл содержал информацию об их расположении.

1r4o nucplot lys — **Рисунок 7.** Nucplot контакта Lys461 с ДНК в комплексе 1r4o.

1r4o nucplot arg — **Рисунок 8.** Nucplot контакта Arg466 с ДНК в комплексе 1r4o.

Аминокислотный остаток с наибольшим числом указанных на схеме контактов с ДНК

Lys461 имеет наибольшее число контактов с ДНК, но все они не за счёт образования водородных связей, а по причине пространственной сближенности атомов (расстояние между контактирующими частицами меньше 3.35Å) - рисунок 7. Таких контактов согласно nucplot три. Рисунок 9 показывает представление контактов в Pymol. Видно, что это два из них - взаимодействия углерода и азота, которых стабильными нельзя назвать. Стоит упомянуть, что наибольшее число контактов с ДНК уже за счёт водородных связей у Arg466 (рисунок 8).

1r4o lys pymol — **Рисунок 9.** Иллюстрация контакта между Lys461 и гуанином. Представление остовов белка (розовый) и ДНК (песочный) в режиме cartoon, окраска 461 лизина и 4 гуанина в режиме sticks (окраска по атомам). Желтыми штрихами представлены ДНК-белковые контакты (<3.35Å).

1r4o arg pymol — **Рисунок 10.** Иллюстрация контакта между Arg466 и гуанином. Представление остовов белка (розовый) и ДНК (песочный) в режиме cartoon, окраска 466 аргинина и 14 гуанина в режиме sticks (окраска по атомам). Желтыми штрихами представлены водородные связи.

Наиболее важный для распознавания последовательности ДНК аминокислотный остаток

Таким остатком будет тот, который связывается с каким-нибудь азотистым основанием. Lys461 образовывает контакты с гуанином, но на мой взгляд, две водородные связи между другим гуанином и Arg466 будут прочнее и важнее для распознавания последовательности ДНК. Рисунок 10 показывает, что образуются водородные связи между азотом и азотом, азотом и кислородом.