Практикум 4

Автор старался, но не может гарантировать отсутствие биологических ошибок.

1. Составление списка гомологичных белков, включающих паралоги

Был проведен поиск достоверных гомологов белка CLPX_ECOLI среди раннее выбранных мною бактерий. Для этого воспользовались файлами полных протеомов бактерий, лежащими на kodomo в директории /P/y22/term4/Proteomes. Протеомы моих бактерий были перенесены в общий файл ~/term4/pr4/myproteomes.fasta для дальнейшего создания библиотеки на их основе. Затем был проведен поиск программой blastp (Protein-Protein BLAST 2.11.0+) гомологов по протеомам моих бактерий. Далее представлены использованные команды:

aliserana@kodomo:/P/y22/term4/Proteomes$ cat AROAE.fasta BURMA.fasta HAEIN.fasta NEIMA.fasta POLAQ.fasta ROSDO.fasta SERP5.fasta THIDA.fasta > ~/term4/myproteomes.fasta

aliserana@kodomo:~/term4$ makeblastdb -dbtype prot -in pr4/myproteomes.fasta -out myprot_db

aliserana@kodomo:~/term4/pr4$ blastp -db myprot_db -query P0A6H1.fasta -out homologs -evalue 0.0005

Список находок из выдачи BLAST: файл, распределение по организмам - таблица 1.

**Таблица 1.** Число находок достоверных гомологов белка CLPX_ECOLI из выдачи blastp для каждой из отобранных бактерий.
Название	Мнемоника	Количество находок	ID находок
Aromatoleum aromaticum	AROAE	2	CLPX_AROAE, HSLU_AROAE
Burkholderia mallei	BURMA	3	CLPX_BURMA, HSLU_BURMA, A0A0H2WJ72_BURMA
Haemophilus influenzae	HAEIN	3	CLPX_HAEIN, HSLU_HAEIN, FTSH_HAEIN
Neisseria meningitidis	NEIMA	2	CLPX_NEIMA, RUVB_NEIMA
Polynucleobacter asymbioticus	POLAQ	2	CLPX_POLAQ, A4SXL5_POLAQ
Roseobacter denitrificans	ROSDO	3	CLPX_ROSDO, HSLU_ROSDO, RUVB_ROSDO
Serratia proteamaculans	SERP5	4	CLPX_SERP5, HSLU_SERP5, A8GCD8_SERP5, A8G901_SERP5
Thiobacillus denitrificans	THIDA	4	CLPX_THIDA, Q3SFW1_THIDA, Q3SJR4_THIDA, Q3SJH1_THIDA

2. Реконструкция и визуализация

Подоготовка последовательностей

Поместим последовательности находок в fasta-файл, отредактировав названия - оставим только ID.

Реконструкция дерева

Реконструируем дерево найденных гомологов через сервис NGPhylogeny конвейером из MAFFT и программы FastME со следующими параметрами: "Gamma distributed rates across sites" — No, "Starting tree" — BIONJ, "No refinement", 100 бутстреп реплик. Ссылка на результат. Newick формула дерева без укоренения, с укоренением в среднюю точку. На рисунке 1 представлено полученное дерево после укоренения в среднюю точку.

The tree for my homologs — **Рисунок 1.** Визуализация дерева (MAFFT, FastME) отобранных гомологов iTOL с укоренением в среднюю точку.

Паралоги и ортологи

Будем считать, что наше дерево реконструировано правильно. Найдем по нему пары паралогов и ортологов. Считаем, что гомологичные белки ортологи, если они из разных организмов, разделение их общего предка на линии, ведущие к ним, произошло в результате видообразования, два белка - паралоги, если они из одного организма.

Паралоги

RUVB_ROSDO и CLPX_ROSDO
A8G902_SERP5 и HSLU_SERP5
Q3SFW1_THIDA и Q3SJR4_THIDA

Ортологи

CLPX_THIDA и CLPX_HAEIN
RUVB_NEIMA и RUVB_ROSDO
HSLU_SERP5 и HSLU_HAEIN

Изображения дерева

Изобразим разные ортологические группы (то есть наборы попарно ортологичных белков) разными цветами (две группы, содержащие две последовательности, остались чёрными) - рисунок 2.

FISH - группа АТФ-зависимых цинк металлопротеаз, контролирует качество интегральных мембранных белков.
HSLU - группа АТФазных субъединиц HslU АТФ-зависимых протеаз. Связывание АТФ и его последующий гидролиз необходимы для подготовки субстрата к HslV гидролизу.
CLPX - группа АТФ-связыващих субъединиц ClpX АТФ-зависимых протеаз Clp. ClpX направляет протеазу к специфичному субстрату.

Orthologous groups — **Рисунок 2.** Ортологические группы среди исследуемых белков: голубой - FTSH белки, фиолетовый - HSLU, розовый - CLPX.

Orthologous groups collapsed — **Рисунок 3.** Дерево со "схлопнутыми" ортологическими группами: голубой - FTSH, фиолетовый - HSLU, розовый - CLPX.

"Схлопнем" все ортологические группы, содержащие более трёх последовательностей - рисунок 3. Таблица 2 показывает белки каких бактерий отстуствуют в данных ортологических группах. По рисункам 4-6 определим соответствие филогений белков и бактерий (дерево).

FISH - для представленных в ней белков филогения по ним полностью соответствует филогении бактерий.
HSLU - для представленных белков наблюдается несоответствие внутри клады {HSLU_AROAE, HSLU_BURMA, Q3SFW1_THIDA} с соответствующей для бактерий, в остальном деревья совпадают.
CLPX - филогения белков не соотвествует филогении бактерий. Правильно выделены нетривиальные ветви для {SERP5, HAEIN}, {AROAE, THIDA, BURMA, POLAQ}. При этом филогения внутри последней клады для белков не совпадает с той у бактерий.

Orthologous group FTSH — **Рисунок 4.** Ортологическая группа FTSH.

Orthologous group HSLU — **Рисунок 5.** Ортологическая группа HSLU.

Orthologous group CLPX — **Рисунок 6.** Ортологическая группа CLPX.

**Таблица 2.** Состав "схлопнутых" ортологических групп.
Группа	FTSH	HSLU	CLPX
Число белков	5	6	8
Состав	A0A0H2WJ72_BURMA, FTSH_HAEIN, A4SXL5_POLAQ, A8G901_SERP5, Q3SJR4_THIDA	HSLU_AROAE, HSLU_BURMA, HSLU_HAEIN, HSLU_ROSDO, HSLU_SERP5, Q3SFW1_THIDA	CLPX_AROAE, CLPX_BURMA, CLPX_HAEIN, CLPX_NEIMA, CLPX_POLAQ, CLPX_ROSDO, CLPX_SERP5, CLPX_THIDA
Непредставленные организмы	AROAE, NEIMA, ROSDO	NEIMA, POLAQ	-