Поиск и описание полиморфизмов пациента

Сравнение исходных и очищенных чтений

Рисунок 1. Выдача программы FastQC с неочищенными ридами

Рисунок 2. Выдача программы FastQC с очищенными ридами

---

Число чтений до чистки: 5524;
Число чтений после чистки: 5227;
Отсеялись все чтения длиной качественной части менее 50. Остальная выдача FastQC имеет незначительные различия; упоминания стоит лишь распределение последовательностей по длине:

Рисунок 3. Распределение длин неочищенных ридов

Рисунок 4. Распределение длин очищенных ридов

---

Из этой выдачи видно, что последовательности длиной более 100 часто укорачивались из-за низкокачественных концевых участков, а последовательности длиной менее 50 нуклеотидов выбрасывались.

Картирование чтений и анализ выравнивания

Далее работа шла с очищенными чтениями. С помошью программы HISAT2 риды были откартированы, а затем с помощью пакета SAMTools проанализированы. Команды:
hisat2-build ref-chr19.fasta ref-chr19 > hisat2-build.log
hisat2 --no-spliced-alignment --no-softclip -x ref-chr19 -U chr19.trimmed.fastq -S chr19.sam 2> hisat2.log
samtools view chr19.sam -o chr19.bam
samtools sort chr19.bam -o chr19.sorted.bam
samtools index chr19.sorted.bam
samtools depth --reference ref-chr19.fasta chr19.sorted.bam > chr19.sorted.depth.tab
samtools depth -a --reference ref-chr19.fasta -r chr19:17322704-17324104 chr19.sorted.bam > chr19.myo9b.depth.tab

Параметры hisat2:
--no-spliced-alignment – запрещает создавать гэпы (больших размеров) в выравнивании.
--no-softclip – запрещает мягкое обрезание последовательностей.
-x <basename> – 'basename' индекса референсного генома.
-U <file> – список файлов с ридами.
-S <file> – файл SAM для записи вывода.
--snp <file> – вывод в файл списка SNP. (Возникает вопрос, для чего вообще используется SAMTools в дальнейшем? Возможно, из-за проблем с несовместимостью форматов?)
2> <file> – запись потока stderr в файл.
Параметры samtools:
<any module> -o – имя выходного файла.
depth -a – производить запись даже о нуклеотидах с нулевым покрытием. (Необходимо (sic!) для корректного определения среднего покрытия)
depth -r – регион для отображения.

В файле hisat2.log указано, сколько чтений картировано на хромосому. Оказалось, что:
Картированы 5206 ридов;
Не картирован 21 рид;
Для анализа покрытия экзона был выбран нуклеотид с хорошим покрытием (позиция 17323412). С помощью GenomeBrowser были определены границы экзона гена MY09B: 17322704 – 17324104. Среднее покрытие нуклеотидов экзона ридами составило 37,6 (с учётом непокрытых нуклеотидов).

Поиск SNP

С помощью пакетов SAMTools и BCFTools был проведён поиск полиморфизмов в ридах. Команды:
samtools mpileup -u -f ref-chr19.fasta chr19.sorted.bam -o chr19.sorted.mpileup.bcf
bcftools call -c -O v -v chr19.sorted.mpileup.bcf -o chr19.sorted.snp.vcf

Параметры samtools:
<any module> -o – имя выходного файла.
mpileup -u – вывод – несжатые (uncompressed) файлы BCF.
mpileup -f – референс-файл в формате fasta.
Параметры bcftools:
<any module> -o – имя выходного файла.
call -c – вызов консенсуса.
call -O <type> – формат вывода (v = raw VCF).
call -v – выводить только варьирующие сайты.

Анализ полиморфизмов:

Лишь у немногих (16 из 93) полиморфизмов покрытие превышает 20. Качество большинства не превышает 100.

Аннотация SNP

С помощью комплекта программ ANNOVAR были аннотированы полученные снипы по различным базам данных. Команды:

• В результате получено множество файлов с аннотациями. (В директории они переименованы для удобства)
• База данных RefGene делит снипы на интронные (76), экзонные (12) и UTR3 [3'-нетранслируемые участки] (5).
• SNP попадают в гены MYO9B (68), MPV17L2 (5), TOMM40 (20).
• Присутствуют три несинонимичные замены: MYO9B: [T]S → [G]A, [T]V → [C]A; MPV17L2: [A]M → [G]V. Остальные экзонные замены меняли только последовательность гена, но не кодируемого белка.
• 79 из 94 снипов содержится в RefSNP.
• 78 SNP нашлись в популяции из 1000. Следовательно, вероятность найти данный SNP у одного человека в популяции из 1000 человек приблизительно составляет не менее 1/1000*78/93 ≈ 0.00084.
• При этом 4 SNP были проаннотированы, что составляет почти 5% от всех найденных снипов. В целом для пациента нахождение данных мутаций может лишь знакомить его с рисками получения некоторых осложнений, так как на данный момент не существует прямого способа их лечения (как то: болезни Альцгеймера и других). Проаннотированны следующие болезни: Height; Multiple sclerosis; Alzheimer's disease (late onset); Metabolic syndrome.
• В базе данных ClinVar не нашлось ни одного снипа.

Мною была составлена сводная таблица всех аннотаций SNP, сделанных ранее.