β2-адренергический рецептор, или β2-адренорецептор, или β₂AR (PDB ID: 2RH1, Uniprot ID: P07550) является одним из модельных трансмембранных рецепторов, чья структура и функция досконально изучена и на примере которых были разработаны основные методы для работы с трансмембранными белками. В нашей работе приведена общая характеристика β₂AR, подробно рассмотрены различные типы контактов с его участием, их геометрические параметры, выдвинуты предположения о структурной и функциональной роли этих контактов, по возможности подкреплённые доказательствами из литературы.

Биосигнализация

β₂AR относится к классу рецепторов, сопряжённых с G-белком (англ. G-protein-coupled receptors, GPCRs). β₂AR опосредует катехоламин-индуцированную активацию аденилатциклазы через действие G-белков, находящихся на внутренней стороне мембраны. Gs-белки, участвующие в биосигнализации, стимулируют синтез cAMP аденилатциклазой. cAMP, в свою очередь, аллостерически активирует протеинкиназу A (PKA), которая фосфорилирует другие белки, активируя их [1]. Дальнейшая часть молекулярного каскада обеспечивает эффекты агонистов β₂AR (Рис. 1).

Физиологическая роль

Ген, кодирующий β₂AR, экспрессируется во многих тканях, в основном в гладких мышцах, жировой ткани и лейкоцитах [2]. В гладких мышцах активация рецептора стимулирует их расслабление, в жировых клетках активирует липолиз, в лейкоцитах по-разному изменяет их активность в зависимости от типа, возраста и цитокинового окружения лейкоцита [3], [4], [5]. Следовательно, мутации в гене β₂AR тесно связаны с предрасположенностью к бронхиальной астме, сердечно-сосудистым заболеваниям и сахарному диабету II типа [6], [7].

Структура

β₂AR Состоит из семи пронизывающих мембрану гидрофобных α-спиралей по 20-25 аминокислот в каждой, 3-х внеклеточных и 3-х внутриклеточных гидрофильных петель, внеклеточного N-концевого и внутриклеточного C-концевого доменов, формирующего α-спираль, присущую, как считается, всем GPCRs. Также α-спираль формирует середина второй внеклеточной петли [8]. Помимо этого в 2-х трансмембранных α-спиралях обнаружено по одной π-спирали, обеспечивающие их изгиб.

Из аминокислотных остатков наиболее важными являются остатки, составляющие центр связывания лиганда (см. Обратный агонист (S)-каразолол). Не менее важны остатки, отвечающие за связывание с G-белком, но в исследуемой структуре большая их часть удалена вместе с 3-ей внутриклеточной петлёй, поэтому в данной работе они не рассматриваются.

В нашей работе рассматривается структура химерного белка – β₂AR-T4L: 3-я внутриклеточная петля человеческого β₂AR заменена на T4-лизоцим (T4L) – небольшой гидрофильный и хорошо кристаллизуемый фермент бактериофага T4 (его аминокислотные остатки пронумерованы в pdb-файле четырёхзначными числами). Введение белков с такими свойствами в структуру трансмембранных белков способствует их кристаллизации. Также в исследуемой структуре отсутствуют 28 N-концевых и 22 C-концевых аминокислотных остатка, так как их электронная плотность на этих участках была получена в низком разрешении, и пространственное положение данных остатков определить было невозможно. Химерный белок не способен взаимодействовать с G-белком, но на другие функции β₂AR T4-лизоцим не влияет. В работе в основном рассматриваются контакты, присутствующие в цельном β₂AR [8], [9].

Водородная связь – это слабая нековалентная связь между одним электроотрицательным атомом (акцептором протона) и атомом водорода, связанным с другим электроотрицательным атомом (донором протона). Образуется за счёт того, что на атоме водорода есть δ+, а на не связанном с ним электрооттрицательном атоме есть δ-, что обеспечивает их притяжение.

Межостовные водородные связи в большинстве случаев поддерживают вторичную структуру белка. В β₂AR за счёт таких связей сформированы α-спирали, β-листы и π-спирали (Рис. 3-6). В рассматриваемой α-спирали и β-листе длины водородных связей соответствуют ожидаемым значениям (Табл. 2). В π-спирали они в среднем совпадают с таковыми в α-спиралях, однако если не учитывать неканоничные для π-спиралей i – i+4 связи (№12 и №14) и связь на границе с α-спиралью (№13), то длина водородных связей в π-спиралях (2.72 Å) окажется заметно меньше, чем в α-спиралях, что соответствует литературным данным о меньшем подъёме (rise) π-спирали.

Водородные связи между боковыми радикалом и остовом или между двумя боковыми радикалами могут поддерживать вторичную, третичную и четвертичную структуру белка. Водородная связь O(Ile47)–ND2(Asn51) (Рис. 7) стабилизирует α-спираль, в которой находятся эти остатки, связывая два соседних её витка. Водородная связь OE2(Glu187)–OG1(Thr189) (Рис. 8) создаёт резкий поворот второй внеклеточной петли на 180°, благодаря которому она не закрывает карман с центром связывания лиганда.

В π-водородной связи в качестве акцептора протона выступает π-электронное облако ароматического кольца. Поиск данной связи 4L-β₂AR осуществлялся визуально в JMol. Рассматриваемый пример (Рис. 9) иллюстрирует взаимодействие между гидрофобным ядром (Phe101) и гидрофильной внеклеточной поверхностью рецептора (Thr100).

Previous Next

Солевые мостики – вид электростатического взаимодействия в белке, возникающий между положительно и отрицательно заряженными атомами боковых цепей аминокислотных остатков. Солевые мостики в β₂AR находятся на концах трансмембранных спиралей и во внеклеточных доменах (Рис. 10). Мы рассмотрели два наиболее каноничных из них (Рис. 10, 11), длины которых не выходят за рамки среднестатистических значений (Табл. 3).

Солевой мостик, образованный парой Arg¹³¹/Asp¹³⁰, способствует формированию другого солевого мостика, Arg¹³¹/Glu²⁶⁸, который соединяет внутриклеточные концы 3 и 6 трансмембранных спиралей, создавая "ионный замок" [16]: при образовании этого мостика рецептор неспособен взаимодействовать с G-белком (Рис. 12). Так как в рассматриваемой структуре рецептор связан с обратным агонистом, то он находится в активной форме, поэтому мостик Arg¹³¹/Glu²⁶⁸ здесь отсутствует.

Солевой мостик His¹⁷²/Glu¹⁰⁷ связывает внеклеточные концы 3 и 4 трансмембранных спиралей. Вероятно, это фиксирует их пространственное положение.

Дисульфидная связь – это ковалентная связь между двумя атомами серы остатков цистеина. Образуется при окислении двух несвязанных остатков цистеина [1]. В исследуемом белке обнаружены две дисульфидные связи (Рис. 13). Они были найдены путём выделения в белке остатков цистина - димера цистеина. Длины дисульфидных связей соответствуют ожидаемым значениям (Табл. 4). Данные 2 дисульфидных мостика находятся на 2-х внеклеточных петлях рецептора, один из них соединяет эти петли. Видимо, это играет важную роль в обеспечении взаимодействия лиганда с рецептором, так как замещение формирующих мостики цистеинов вызвало снижение аффинности связывания агонистов на величины от 1 до 3 порядков и на 1 порядок для антагонистов [19]. Скорее всего это вызвано тем, что 2-я внеклеточная петля без фиксирующих её положение дисульфидных мостиков загораживает карман с центром связывания, создавая физическую преграду для проникновения туда лиганда.

Стэкинг-взаимодействия – нековалентные взаимодействия ароматических колец, обусловленные притяжением между положительно заряженными атомами одного кольца и отрицательно заряженным π-электронным облаком по обе стороны от другого кольца, в результате чего перекрываются π-орбитали двух колец. Выделяют параллельно сдвинутый стэкинг – с параллельно расположенными кольцами, и Т-стэкинг – с перпендикулярными кольцами. В β₂AR стэкинг обильно представлен в гидрофобных ядрах (Рис. 14-15). В нашей работе рассмотрены типичные примеры таких взаимодействий (Табл. 5).

π-катионный стэкинг (π-катионные взаимодействия) – нековалентные взаимодействия между π-электронным облаком ароматического кольца и расположенным над ним катионом, в случае белков с радикалами аргинина или лизина. В исследуемом белке обнаружено взаимодействие аргинина с тирозином во 2-ой внеклеточной петле (Рис. 16). Скорее всего оно обеспечивает компактную укладку петли вместе с дисульфидными мостиками и водородной связью №17.

Гидрофобные взаимодействия – явление слипания гидрофобных радикалов в белке в гидрофобные ядра, обусловленное тем, что образование контактов между водой и неполярными молекулами термодинамически не выгодно: любая гидрофобная молекула в водном растворе окружена структурированной оболочкой из молекул воды (сольватной оболочкой). Возрастание упорядоченности молекул воды в сольватной оболочке по сравнению с чистой водой характеризуется неблагоприятным с термодинамической точки зрения понижением энтропии. Однако если неполярные группы растворенного вещества собираются вместе и образуют кластеры, то размеры сольватной оболочки уменьшаются, так как тогда не вся поверхность неполярных групп экспонирована в раствор, энтропия повышается. Поэтому по второму закону термодинамики образуются гидрофобные взаимодействия [1]

Так как β₂AR трансмембранный, гидрофобные ядра представлены в нём в большом количестве (Рис. 17). Их можно найти командой select hydrophobic, а выделить из них одно гидрофобное ядро можно с помощью соответствующего сервиса [22].

Для исследования плотности упаковки атомов в гидрофобном ядре было выбрано окружение тирозина Tyr³²⁶. Атомы на расстоянии в 1 ангстрем отсутствуют, и только начиная с расстояния в 2 ангстрема, появляются два атома. Начиная с расстояния в 7 ангстрем, атомы Tyr³²⁶ практически полностью закрыты. Для вычисления характерного расстояния между соседними не связанными ковалентно атомами в гидрофобном ядре было рассчитано среднее 25 расстояний (Рис. 18). Среднее расстояние оказалось равным 4,24 ангстрем (Табл. 6). Межатомное расстояние, необходимое для размещения молекулы воды (принимается за один атом кислорода, так как атомы водорода пренебрежимо малы) можно рассчитать, исходя из ван-дер-ваальсовых радиусов кислорода (1,4 Å) и углерода (1,85 Å) [23]. Оно равно: 2*1,4 + 2*1,85 = 6,5. Так как максимальное измеренное расстояние между атомами меньше этого значения, то молекула воды поместиться в это гидрофобное ядро не может. Расчёт проведён для атомов углерода, так как при рассмотрении размещения воды между другими атомами не учитываются их соседние атомы углерода, из-за которых реальное свободное пространство между атомами может оказаться меньше рассчитанного (именно углерода, так как у него наибольший радиус).

При рассмотрении взаимодействий лигандов (Табл. 1) с рецептором было найдено большинство типов связей, описанных ранее (Рис. 19-24). Поиск связей осуществлялся визуально после применения команды select within('Group', within(6.0, <Код лиганда>)), которая выделяет все аминокислотные остатки, способные взаимодействовать с лигандом. Сульфат связан с белком многочисленными ионными мостиками, ацетамид – прочной ковалентной связью через цистеин, пальмитиновая кислота – тоже через цистеин, тиоэфирной связью. Пальмитилирование Cys³⁴¹ способствует заякориванию C-конца рецептора и имеет большое функциональное значение: замена этого остатка приводит к образованию нефункциональной формы рецептора, неспособной взаимодействовать с G-белком [10]. Также пальмитиновая кислота гидрофобно взаимодействует с холестеролом. Холестерол имеет обширные гидрофобные взаимодействия с остатками валина и фенилаланина. 1,4-бутандиол и додекаэтиленгликоль тоже гидрофобно слипаются с белком. Это подтверждается расстояниями между атомами углерода в этих лигандах и белке, близкими к таковым расстояниям в исследованном гидрофобном ядре. Длины измеренных связей других типов тоже не сильно отличаются. Также холестерол и додекаэтиленгликоль образуют водородные связи с молекулами воды.

Мальтоза (α-D-глюко-гексопиранозил-(1->4)-α-D-глюко-гексопираноза по IUPAC) связана с T4L-доменом водородными связями. Она находится в активном центре лизоцима [24], из чего следует, что он также может связывать углеводы с α-гликозидной связью.

Обратный агонист (S)-каразолол

Особое внимание стоит уделить взаимодействию β₂AR с (S)-каразололом (по IUPAC – (2S)-1-(9H-карбазол-4-илокси)-3-(изопропиламино)пропан-2-олом) – частично обратным агонистом, создающим эффекты, обратные β₂-адренергическим (см. Физиологическая роль). (S)-каразолол находится в глубоком кармане внеклеточной поверхности рецептора (рис. 25). Его карбозольное кольцо связано с рецептором гидрофобными взаимодействиями, T-стэкингом и π-водородной связью (рис. 26). Эти же связи могут возникать при связывании ароматическаих колец катехоламинов. Хвост (S)-каразолола удерживается четырьмя водородными связями, а также гидрофобными взаимодействиями (рис. 27). Так как в молекуле адреналина тоже есть алкиламинная и гидроксильные группы на хвосте, то с адреналином эти связи также образуются, из чего следует, что перечисленные взаимодействия являются ключевыми для связывания лигандов. Исходя из полученных данных, центр связывания лиганда в β₂AR состоит из 8 аминокислотных остатков: Phe¹⁹³, Phe²⁹⁰, Val¹¹⁴, Val¹¹⁷ и Asn²⁹³ связывают ароматическое кольцо лиганда, а Asn³¹², Asp¹¹³ и Trp¹⁰⁹ связывают его хвост. Это число является максимальным, так как лиганды с шестичленными ароматическими кольцами будут образовывать меньше связей, чем (S)-каразолол.

Предсказание программы TMHMM (Рис. 32, Табл. 7) подтверждает наличие у β₂AR 4 трансмембранных участка в виде α-спиралей, находящихся N-концом наружу. На Рис. 28 изображена разметка белка, сделанная по данным о положении элементов относительно мембраны, взятым из базы данных Uniprot, в Jmol, на которой зелёный, красный, оранжевый цвета обозначают внеклеточные, мембранные и внутриклеточные фрагменты соответственно. В других базах данных и программах положение рецептора относительно мембраны не отличается (Рис. 27, 30, 31) [25], [26], [27], [28]. Причём положение одинаково для β₂AR и β₂AR-T4L. Следовательно, T4-лизоцим не влияет на взаимодействие рецептора с мембраной, и большинство структурных предсказаний для трансмембранных участков β₂AR можно получать на примере β₂AR-T4L.