Предсказание генов эукариот

Проверка предсказания на уровне белков

Для проверки случайным образом были выбраны гены g1, g2, g5, g9 и g4. Предсказание проверялось с помощью алгоритма blastp.

1. g1

Результаты оказались не очень благоприятными: на рис. 2 приведены все находки, полученные blastp. Было проведено 2 поиска - по базе данных nr и по SwissProt. Оба варианта дали не очень высокие параметры выравниваний. Кроме того, по nr получается, что белок, кодируемый геном g1, гомологичен экзонуклеазе II из организма Schizosaccharomyces octosporus yFS286 (рис. 2а), а по SwissProt (рис. 2b) - Dentatorubral-pallidoluysian atrophy protein из организмов млекопитающих (мышь, крыса, человек и др.). Такие находки назвать достоверными нельзя.

2. g2

Ситуация с данным предполагаемым белком обстоит еще хуже: гомологи не были найдены ни по одной базе данных. AUGUSTUS полностью ошибся.

3. g5

С этим белком повезло больше: нашлось много гомологов с неплохими параметрами query cover и e-value, самые лучшие из них (приведена на рис. 3) принадлежат Fungi и имеют похожие названия.

Учитывая полученные результаты построения доменной структуры и находки бласта, можно заключить, что белок, закодированный в 5-ом гене, является НАДФ-связывающим.

4. g9

Он аннотировался хорошо, много достоверных находок, но ... они принадлежат в основном муравьям. См. рис.4. Возможно, дело в том, что это 40S-рибосомальный белок. Рибосомальные белки сами по себе являются очень консервативными структурами, поэтому можно предположить вероятность, что даже у настолько филогенетически дальних родственников, как муравей и гриб, эти белки будут сильно схожи.

Для всех выравниваний характерно наличие одного гэпового участка длиной 18 позиций в query. Отсутствующий фрагмент может указывать на то, что AUGUSTUS не нашел один экзон, который должен был быть в мРНК. "Гэповую архитектуру" выравнивания можно увидеть на рис. 5.

5. g4

Судя по результатам blastp (рис. 6), ситуация довольно интересная: высокий query cover, но очень низкое сходство (в общем по находкам Identity < 50%). Тем не мнеее, белок определен как гликозилгидролаза, если верить самым первым находкам, а если не верить им, то как он как минимум входит в семейство белков с альфа-амилазным доменом. Это подтверждается построенной доменной структурой (рис. 6b), а также описанием гипотетического белка из организма Pseudogymnoascus sp. разных штаммов. Оно приведено на рис. 7. Видно, что в нем есть уже упоминавшийся домен.

Так как покрытие последовательности почти 100% в большинстве случаев, а score низкий, можно заподозрить то, что для этого белка была неверно определена экзон-интронная структура. Это заметно по большим фрагментам гэпов в "хороших" выравниваниях (см. рис. 8).

Такой вид выравнивания присущ не только первой находке в списке Blast, но и всем похожим находкам. Скорее всего, при аннотации четвертого гена была нарушена экзон-интронная структура. Это подтверждается тем, что "рисунок" гэпов в выравниваниях примерно одинаков (для примера приведено еще одно выравнивание на рис. 8).

Задание 2. Сравнение аннотации RefSeq и AUGUSTUS для одного гена человека

В качестве проверяемого гена человека был взят ген OGDH, кодирующий фермент 2-оксоглутаратдегидрогеназу. Его Gene ID в NCBI - 4967. Ген закодирован на +-цепи 7 хромосомы, координаты chr7:44606522-44709070 (и размер гена 102549 пн). Использовался ресурс USCS Genome Browser. На рис. 9 показано окно Genome Browser с изображением экзон-интронной структуры гена OGDH с тремя трэками: base position, RefSeq и AUGUSTUS.

При обработке аннотаций RefSeq и AUGUSTUS в табличной форме я столкнулась с проблемой: в RefSeq по Genome Browser было дано целых 3 разных аннотации с идентификаторами NM_002541, NM_001165036, NM_001003941, для них было указано 23, 23 и 9 экзонов соответственно. По-видимому, это были аннотации для разных изоформ белка OGDH. Я проверила каждый из идентификаторов в NCBI, и там было сказано, что на данный момент в этом гене насчитывают 26 экзонов. Таким образом, изоформы, содержащей в себе все количество экзонов, hg38 не представлено. Для дальнейшей работы я оставила аннотацию с идентификатором NM_002541 и 23 экзонами. Аннотация AUGUSTUS была проведена по 3 транскиптам. Количество полученных экзонов различается: в первом (AUGUSTUS t1) аннотировано 23 экзона, во втором (AUGUSTUS t2) - 24, а в третьем (AUGUSTUS t3) аж 41 экзон.

Итак, были получены таблицы с аннотацией RefSeq и AUGUSTUS.
Они были сведены в один файл: Таблица с аннотациями RefSeq и AUGUSTUS.

некоторые выводы о различиях двух приведенных аннотаций:

• Прежде всего нужно заметить, что в аннотации AUGUSTUS начальные и конечные координаты транскрипции отличаются от таковых в аннотации RefSeq, между собой они тоже различны. Помимо отличий в координатах транскрипции есть еще различия в координатах собственно кодирующих последовательностей. Единственным компромиссом, на котором эти аннотации "сошлись", можно считать координату начала cds - во всей аннотациях это 44624343.
• Странным мне показался факт, что и AUGUSTUS, и RefSeq начинают распознавать экзоны с самого начала (со стартовой координаты транскрипции). Это противоречит молекулярной биологии процесса транскрипции, так как помимо экзонов и интронов (в пре-мРНК) мРНК содержит кэп, поли-А хвост на 5'и 3'-концах соответственно, а так же 5'-UTR и 3'-UTR - нетранслируемые посл-ти. Как я понимаю, они как раз занимают ту область между стартовой координатой транскрипции и началом cds и, соответственно, концом cds и конечной координатой транскрипции.
• Из-за вышеописанного пункта в аннотациях неизменно возникают лишь частично кодирующие, а также некодирующие экзоны. В наиболее "широкой" аннотации AUGUSTUS (содержащей 41 экзон) в нетранслируемую область попадают целых 2 полностью некодирущих экзона.
• Конкретно про "большую" аннотацию с 41 экзоном можно сказать, что новые экзоны добавились к списку прежних за счет того, что конечная точка транскрипции оказалась сдвинута на ~100 000 пн вперед за счет увеличения длины кодирующей последовательности примерно на 93 килобаз. Из-за этого в кодирующую последовательность попало на 17 экзонов больше.
• Остаток от деления длины кодирующей последовательности на 3 не всегд равен 0. Это нормально, поскольку из-за нетранслируемых последовательностей рамка считывания может сдвигаться на некоторые количество нуклеотидов. Важно, чтобы суммарная длина cds была кратна трем. Однако в моем случае и это не всегда верно.
• Насчет интронов и их длин можно сказать, что они варьируются тогда, когда меняется экзонный состав всей последовательности.