Реконструкция филогении по нуклеотидным последовательностям. Паралоги.

Задание 1. Построение дерева по нуклеотидным последовательностям

С сервера NCBI для каждой бактерии были взяты нуклеотидные последовательности 16S РНК (из файлов с расширением .frn). Они были собраны в fasta-файл 16S_all.fasta.

Последовательности были выровнены в Jal-view с помощью программы Muscle, выравнивание сохранено в файл 16S_align.fasta. Затем в MEGA с помощью метода Maximum Likelihood было построено филогенетическое дерево (приведено на рис. 1, слева). Для сравнения, на рис. 1 справа показано "правильное" дерево, отвечающее таксономии данных организмов.

Рис. 1. **Слева:** филогенетическое дерево 8 видов бактерий, построенное по посл-тям 16S РНК методом Maximum Likelihood. **Справа:** дерево, построенное на основе таксономии бактерий.

Сходство деревьев оценивается по их топологии, которая, в свою очередь, определяется набором разбиений деревьев на нетривиальные ветви. Поэтому, чтобы сравнить эти два дерева, нужно понять, по-разному ли их можно разбить на пары нетривиальных ветвей. В Таблице 1 приведены эти разбиения и отмечено, для какого дерева оно подходит.

Таблица 1. Разбиения на пары нетривиальных ветвей для дерева, построенного на основе 16S РНК, и дерева, построенного по таксономии.

Разбиение Дерево, полученное методом ML (на основе 16S РНК) "Правильное" дерево на основе таксономии

{RHIEC, RHOS4} vs {NEIMA, PROMH, YERPE, ERWT9, VIBFM, PSEAE} + +

{RHIEC, RHOS4, NEIMA} vs {PROMH, YERPE, ERWT9, VIBFM, PSEAE} + +

{RHIEC, RHOS4, NEIMA, PSEAE} vs {PROMH, YERPE, ERWT9, VIBFM} + +

{RHIEC, RHOS4, NEIMA, PSEAE, VIBFM} vs {PROMH, YERPE, ERWT9} + +

{RHIEC, RHOS4, NEIMA, PSEAE, VIBFM, PROMH} vs {YERPE, ERWT9} + +

Из Таблицы 1 хорошо видно, что наборы разбиений для обоих деревьев совпадают. Это означает, что они одинаковы.

Задание 2. Построение и анализ дерева, содержащего паралоги

Для поиска гомологов белка CLPX_ECOLI была создана база данных из протеомов 8 исследуемых бактерий (на основе файла bact.fasta). Затем среди белков выбранных бактерий были найдены гомологи (с пороговым E-value = 0.001), результат запуска blastp содержится в файле results.txt.

Использованные команды:

makeblastdb -in bact.fasta -dbtype prot -out db.fasta
blastp -query clpx.fa -evalue 0.001 -db db.fasta -out results.txt

Всего находок, соответствующих установленному E-value, 27, однако действительно гомологами, мне кажется, следуюет считать лишь первые 16: с E-value до порядка -20, так как дальше идет резкий переход к E-value порядка -5/-4, а так же названия находок меняются.

При этом внутри найденных последовательностей легко можно выделить 2 группы: собственно белки CLPX (с более хорошими показателями) и белки АТФазной субъединицы протеазы. Гомологи приведены на рис. 2.

*Рис. 2. Выбранные из находoк blastp гомологи белка CLPX_ECOLI. Оранжевым выделена группа белков CLP-протеаз, зеленым - HSLU.*

Далее были взяты полные последовательности 16 гомологов, они были выровнены программой Muscle, по выравниванию в программе MEGA было построено дерево

*Рис. 3. Выравнивание гомологов белка CLPX_ECOLI, построенное с помощью Muscle.*

Рис. 4. Дерево белков ClpX и HslU, построенное на основе их выравнивания с помощью алгоритма Neighbor-Joining. Желтая линия обозначает дупликацию гена в организме ERWT9, в желтых и оранжевых рамках белки-паралоги в организмах PSEAE и PROMH соответственно, в зеленые рамки взяты 2 группы ортологов белков ClpX и HslU, голубые рамки обозначают видообразование.

Во всех выбранных бактериях есть гомологи белка CplX_ECOLI, а белки HslU нашлись во всех, кроме бактерии NEIMA (Neisseria meningitidis).

На этом дереве показаны различные эволюционные события и отношения некоторых белков друг с другом.

Итак, ортологами будем считать белки разных организмов при условии, что разделение их ветвей произошло в результате видообразования, а паралогами будем называть гомологичные белки из одного организма.

На дереве сразу видно дупликацию гена в бактерии ERWT9 (желтая линия справа), которая привела к образованию двух одинаковых белков B2VHU5 и B2VHU8. Некоторые случаи видообразования отмечены голубыми рамками.

Далее, ортологами друг другу являются все белки ClpX (верхняя зеленая рамка на Рис. 4) и HslU (нижняя зеленая рамка), поскольку каждый белок (внутри группы ортологов) отделен веткой, разделяющей виды, от других.

На страницу четвертого семестра