PubMed.

Белок для изучения, что выпал мне, зовется MAPK. На самом деле под этим именем скрывается множество киназ - специальных ферментов, катализирующих перенос фосфатной группы с АТФ на различные субстраты. Сигнальный MAPK-путь является крайне консервативным эукариотическим сигнальным каскадом, обеспечивающий различные ответы на внешние раздражители. Ответ может представлять из себя дифференциацию клеток, их рост.

Для нахождения статьи в PubMed'e были выбраны различные запросы. Они приведены в таблице N1.

Ссылка на мою персональную коллекцию в PubMed'e

Краткое описание open access статьи.

The MAPK kinase Pek1 acts as a phosphorylation-dependent molecular switch (в PubMed'e - 10365961)

В данной статье описывается изучение фермента Pek1.

Ученые заметили, что в природе Pekl связывается с Pmk1,которая является важной MAPK, отвечающей за целостность клетки. Далее было замечено, что мутанты, полученные путем удаления генов, отвечающих за эти киназы, по отдельности и вместе дают одинаковые фенотипы. Стоит добавить, что тем же путем удаления генов (только теперь отвечающих лишь за Pek1) было обнаружено, что Pek1 влияет на степень фосфорилирования тирозина в Pmk1.

Таким образом было доказано, что Pek1 - киназа MAPK Pmk1.

Pmk1 является довольно важной киназой, отвечающей за целостность клетки. Стоит заметить, что и у Pek1 есть киназа (MAPKKK) - Mhk1.

Продолжив исследования, ученые выяснили, что сверхэкспрессия гена, отвечающего за Pek1, дает тот же фенотип, что и удаление данного гена (появление дефекта клеточной стенки). Этот результат подталкивает к мысли о том, что Pek1 может быть как ингибитором, так и активатором.

Была предложена и доказана идея, заключающаяся в том, что сверхэкспрессия гена, отвечающего за Pek1, может повысить количество как фосфорилированных, так и нефосфорилированных белков. Если ингибирование нефосфорилированного фермента превысит стимуляцию фосфорилированного, то сверхэкспрессия гена будет ингибировать Pmk1.

Таким образом, было выяснено, что Pek1 является своебразным переключаетелем, выполняя как ингибиторную, так и активационную роли для Pmk1.

Методы

Нокаут гена pek1⁺ и mkh⁺. Вырезанный с помощью bamhI фрагмент, содержащий pek⁺, длиной 3.2 кБ вставили (субклонировали) в pUC и получили pUC-pek1. pUC-pek1 разрезали в уникальном сайте рестрикции MluI гена pek1⁺ и обработали кленовским фрагментом с образованием тупых концов, затем слигировали с геном ura4⁺ дрожжей S. prombe (длина фрагмента 1.8 кБ). эту конструкцию использовлаи для трансформации гаплоидных клеток

Следующим этапом становится экспрессия Pek1 в дрожжах. Фрагмент BamHI, содержащий кодирующую последовательность pek1+ был аплифицирован с помощью PCR, вставлен в BamHI участок pREP1-GST, чтобы создать pREP1-GST-pek1⁺. Для нормальной экспрессии Pek1 был использован интегрирующий вектор pJK1458, содержащий leu1⁺ в качестве селектируемого маркера. PstI-NotI фрагмент, содержащий эндогенный промотор и кодирующую последовательность pek1⁺, амплифицированную с помощью PCR, а также NotI-SacI фрагмент, содержащий тройные повторения HA-пептида, были субклонированы в PstI-SacI участки pJK148, чтобы сформировать pJK148-pek1-HA. pJK148-pek1-HA была линеаризована на одиночном NruI участке и интегрирована на локус leu1-32 каждого штамма. сайт-специфичный мутагенез pek1^A или pek1^DD были представлены при использовании Sculptor mutagenesis kit(Amersham).

Последний этап - анализ киназ. Pmk1-HA и дикий тип мутантных форм GST-Pek1 были отфильтрованы из клеток, несущих подходящие плазмиды. Киназные реакции, состоящие из иммунопреципитациированной Pmk1-HA, GST-слившихся Pek1 мутантов, а также из неполного буфера, дополнены АТФ и MBP. Реакции были инкубированы 30 минут при 30 градусах Цельсия. Дальше следует SDS-PAGE. Визуализация представлена в виде авторадиографии. Фосфорилированный MBP был извлечен из геля и подсчитан. Анти-фосфо-Pmk1 антитела были приготовлены вакцинированием кроликов синтетическим фосфопептидом, конъюгированным с фиссурелловыми гемоцианином при помощи глютаральдегида.

Ссылка на статью