Учебный сайт Николаевой Дарьи

Комплексы ДНК-белок

1. ДНК-белкового комплекса в ленточной модели, покрашенного в соответствии с вторичной структурой
2. только ДНК в стержневой модели, покрашенной cpk (по цветам атомов)
3. ДНК в стержневой модели и набора атомов set1 (множество атомов кислорода 2'-дезоксирибозы), показанного шариками красного цвета
   • Команда:

     define set1 (*:*.O?')

4. ДНК в стержневой модели и набора атомов set2 (множество атомов кислорода в остатках фосфорной кислоты), показанного шариками желтого цвета
   • Команда:

     define set2 (*:*.O?P and dna)

5. ДНК в стержневой модели и набора атомов set3 (множество атомов азота в азотистых основаниях), показанного шариками синего цвета
   • Команда:

     define set3 (*:*.N? and dna)

   
   

   После того, как структура загрузится, надо нажать две кнопки: 1. Запустить скрипт: 2. Продолжить исполнение скрипта: Text of the script 1 Text of the script 2 Jmol output:

   
   
   Упражнение 2.
   В данном упражнении было нужно описать ДНК-белковые контакты в заданной структуре и сравнить количество контактов разной природы. Это было сделано в программе JMol с помощью скрипта Contacts, который последовательно отображает необходимые (полярные или неполярные) атомы белка, находящиеся на требуемом расстоянии от определенного набора атомов, и сам набор атомов. Для удобства использовались отдельно наборы полярных и неполярных атомов, так как они образуют разные типы контактов (подробнее см. ниже).
   Для выполнения упражнения определим понятия полярных и неполярных атомов и контактов:
   
   • Полярные атомы: "N", "O"
   • Неполярные атомы: "S", "P", "C"
   • Полярный контакт - пара полярных атомов белка и ДНК, расстояние между которыми меньше 3.5Å
   • Неполярный контакт - пара неполярных атомов на расстоянии меньше 4.5Å
   
   Под контактом подразумевается потенциальная связь требуемой длины. Один атом способен образовывать более одного контакта соответствующего типа.
   При выполнении упражнения использовались группы атомов, определенные при выполнении предыдущего упражнения (set1-set2 - группы полярных атомов), а также наборы:
   
   1. set4 (множество атомов углерода 2'-дезоксирибозы), показанное шариками белого цвета (неполярная группа)
      • Команда:

        define set4 (*:*.C?')

   2. set5 (множество атомов фосфора остатков фосфорной кислоты), показанное шариками белого цвета (неполярная группа)
      • Команда:

        define set5 (*:*.P and dna)

   3. set6 (множество полярных атомов азотистых оснований, обращенных в большую бороздку), показанное шариками красного цвета (полярная группа)
   4. set7 (множество неполярных атомов азотистых оснований, обращенных в большую бороздку), показанное шариками белого цвета (неполярная группа)
   5. set8 (множество полярных атомов азотистых оснований, обращенных в малую бороздку), показанное шариками красного цвета (полярная группа)
   6. set9 (множество неполярных атомов азотистых оснований, обращенных в малую бороздку), показанное шариками белого цвета (неполярная группа)
   
   При определении множеств атомов азотистых оснований, обращенных в большую и малую бороздки, я пользовалась данными об остатках, полученными мной и моими однокурсниками при выполнении задания 3 прошлого практикума.
   Результатом выполнения задания является Таблица 2, а также можно пронаблюдать интересующие контакты в JMol-апплете.
   
   Таблица 2. Контакты разного типа в комплексе 1PP7_old.pdb.
   

   Контакты атомов белка с	Полярные	Неполярные	Всего
   остатками 2'-дезоксирибозы	5	41	46
   остатками фосфорной кислоты	9	14	23
   остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки	3	10	13
   остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки	4	1	5

   
   
   При выполнении этого задания были получены довольно интересные данные. Как нетрудно заметить, посмотрев на данные в Таблице 2 или на сами структуры, белок довольно мало взаимодействует с ДНК. Даже визуально они находятся не слишком близко, и только некоторые участки белка подходят ближе к цепи ДНК. В этих нескольких небольших участках и сконцентрированы все атомы, потенциально образующие контакты. Таким образом, можно предположить, что ДНК имеет довольно короткие сайты связывания с конкретным белком.
   Во взаимодействии представлено значительно больше неполярных контактов (в 5 раз больше). Также намного больше контактов с сахарофосфатным остовом, это типично для "заякоривания" ДНК-связывающих белков на ДНК. Однако функциональное связывание белка должно происходить с азотистыми основаниями (вообще типично, что белок должен узнавать некий паттерн ДНК). В моем случае можно сказать, что белок связывается с последовательностью в большой бороздке.
   Что интересно, сначала я посчитала количество контактов на глаз, а затем решила посчитать более точно и измеряла расстояния между атомами. Во втором случае получилось гораздо меньше контактов.
   Упражнение 3.
   В данном упражнении требовалось получить схему ДНК-белковых контактов с помощью программы nucplot. Для ДНК-белковой структуры я получила файл nucplot.ps с данными о популярных контактах, затем я конвертировала его в формат .jpg. С результатом визуализации работы программы nucplot можно ознакомиться на Рис 4a-b.
   
   
   Рис. 4a. Схема ДНК-белковых взаимодействий инициаторного белка связывания в Trychomonas vaginalis с ферредоксиновым инициаторным сайтом; часть 1.
   
   
   Рис. 4b. Схема ДНК-белковых взаимодействий инициаторного белка связывания в Trychomonas vaginalis с ферредоксиновым инициаторным сайтом; часть 2.
   
   
   Упражнение 4.
   Для выполнения этого упражнения я выбрала на полученной схеме два остатка:
   
   • аминокислотный остаток с наибольшим числом указанных на схеме контактов с ДНК (Рис. 5а). Мне было трудно сделать выбор, так как большинство остатков связаны с ДНК через молекулы воды. Единственный остаток, контактирующий с ДНК без посредства воды более, чем 1 раз, это остаток 81 аспарагина (цепь U). Он связан с 7 тимином и 33 цитозином. Однако согласно схеме, данные контакты даже не являются связями, просто расстояние между атомами менее 3.35Å.
   • аминокислотный остаток, наиболее важный для распознавания последовательности ДНК (Рис. b). С выбором данного остатка было еще сложнее. В схеме нет какого-либо остатка, который был бы связан с ДНК большим количеством связей. К тому же, многие контакты идут через посредничество воды. Предположительно, это может быть вышеупомянутый остаток 81 аспарагина.
     Я решила разобраться в этом и прочитала статью людей, которые тоже хотели в этом разобраться. Оказалось, что влияние многих остатков крайне неочевидно, и потребовались эксперименты для проверки гипотез.
     Следует сказать, что рассматривается взаимодействие между инициаторным белком IBP39 (Inr binding protein 39kDa), который связывается с инициаторным участком Inr. У большинства эукариот решающий вклад в инициацию транскрипции вносит связывание инициаторного белка с последовательностью ТАТА-box, а связь с Inr и нижележащим элементом (downstream element) носят некий регуляторный характер. Но у данного организма (Trichomonas vaginalis), являющегося одним из наиболее примитивных представителей эукариот, наибольшую значимость имеет именно связывание инициаторного белка с Inr. Вообще, белок IBP имеет N-конец, связывающийся с ДНК (как раз и представлен на структуре), далее некую связку и С-конец, который связывается с РНК-полимеразой II.
     В рассматриваемом нами N-конце большую роль при связывании играют, во-первых, связи с фосфатами, которых большое количество, так как они наиболее соответствующим образом располагают белок относительно инициаторного сайта, коим является последовательность ACTTC. Область белка, связывающаяся с этим сайтом, называется α6, и именно ей принадлежит мой 81 аспарагин, так что моя гипотеза относительно оправдалась. Однако с помощью метода флюоресцентной поляризации было показано, что без связывания белка (петля 3₁₀) с остатком тимина 27 (цепь Е) и аденина 13 (цепь F), расположенными выше относительно инициаторного сайта (upstream the Inr core region) дальнейшее связывание с инициаторным сайтом не происходит. Поэтому на Рис. 5b я изобразила взаимодействие 28 аргинина и 25 лизина с вышеупомянутыми основаниями.
   
   
   
   Рис. 5a. Изображение аминокислотного остатка ASN81 (цепь U) и двух его контактов с 7 тимином и 33 цитозином ДНК (не являются водородными связями).
   
   
   
   
   Рис. 5b. Изображение аминокислотных остатков ARG28 и LYS25 (U) с T27 (E) и A13 (F) ДНК соответственно; между лизином и аденином водородная связь, между тимином и аргинином - контакт.