Исследование ДНК-белковых взаимодействий в структуре комплекса регуляторного белка PHO4 с молекулой ДНК

  1. Краткое описание структуры в файле 1A0A.pdb

    2. В файле приведены координаты атомов следующих молекул
    1) две цепи ДНК -(фрагмент - UPSTREAM ACTIVATION SITE)
    2) белок (позитивный регулятор фосфатной системы PHO4), фрагмент - связывающий ДНК домен
    Организм - Saccaromyces cerevisiae (Пекарские дрожжи)
    Для исследования были выбраны цепи ДНК со следующей последовательностью:

    цепь C [1]  5' - CTCACACGTGGGACTAG - 3' [17] 
                 |||||||||||||||||  
цепь D [17] 3' - GAGTGTGCACCCTGATC - 5' [1],

  2. Функции белка, структура которого представлена в файле 1A0A.pdb

    3. В соответствующем документе UniProt описаны функции белка: активатор транскрипции, который регулирует образование ингибируемой фосфатазы в условиях дефицита фосфатов. Связывается с активирующей последовательностью в начале гена (upstream activating sequence - UAS) нескольких фосфатаз, включая гены PHO. Ингибируется комплексом циклина с циклинзависимой киназой при избытке фосфатов. Этот белок связывается с ДНК как гомодимер.

  3. Исследование структуры ДНК

    4. Сначала преобразуем файл в старый формат с помошью программы remediator
    remediator --pdb --old 1A0A.pbb > 1A0A_old.pdb
    и с помошью RasMol вырежем только ДНК в отдельный файл DNA.PDB, но и с ним не все просто - все нуклеотиды обозначены двумя буквами - DA, DT и так далее. Чтобы использовать find_pair, удалим все буквы D в редакторе Far.
    Теперь можно использовать команду:
    find_pair -t DNA.PDB stdout | analyze
    Мы определили:
    Тип формы ДНК - правозакрученная спираль:
    This is a right-handed nucleic acid structure
    Cредние значения торсионных углов для внутренних нуклеотидов (кроме краевых). Исследуем и сравним их с помошью средств Excel. Получим таблицы и диаграммы. Файл в формате excel - angles.xls Найдем самый "кривой" нуклеотид со значениями торсионных углов, наиболее отклоняющимися от средних. Это G-11.Кроме этого сильно изменены нуклеотиды под номерами 2, 4, и 12. На рисунке они отмечены красным цветом на зеленой спирали ДНК. Видно, как альфа-спирали белка "вклиниваются" между цепями ДНК, заставляя молекулу изгибаться в соответствующих местах. Тем не менее, в моем случае нельзя сказать, что белок сильно изменяет конформацию ДНК, скорее слегка корректирует ее для успешного взаимодействия.

  4. Исследование природы ДНК-белковых контактов

    5. Для исследования ДНК-белковых контактов используем скрипт my_dna.def, в котором определятся необходимые множества атомов. Cкрипт работает со старым форматом - с файлом 1A0A_old.pdb. При выполнении скрипт последовательно показывает атомы, взаимодействующие с остатками фосфорной кислоты (множества pa_pol и pa_npol), остатками дезоксирибозы (множество dr) , с большой и малой бороздками. Полярные взаимодействия - красные , неполярные - оранжевые. Замечу, что взаимодействий в целом не очень много, и нет никаких взаимодействий с малой бороздкой, что вполне очевидно и так (см картинку выше). Количество взаимодействий занесем в таблицу:

    Таблица. Контакты разного типа в комплексе 1А0А.pdb

    Контакты атомов белка с Полярные Неполярные Всего
          остатками 2'-дезоксирибозы 6 17 23
          остатками фосфорной кислоты 16 24 40
          остатками азотистых оснований со стороны большой бороздки 8 8 16
          остатками азотистых оснований со стороны малой бороздки 0 0 0

  5. Получение популярной схемы ДНК-белковых контактов с помощью nucplot

    6. Используем старый формат PDB
    nucplot 1A0A_old.pdb
    Получили картинку

    Сравнивая эти контакты с теми, которые мы обнаружили с помощью RasMol, можно заметить, что хотя число контактов отличается (мы с программой по-разному понимаем критерии взаимодействия) общие тенденции сохраняются, то есть мало контактов с основаниями, больше с остовом (с остатками фосфорной кислоты больше, чем с сахаром). Если сравнить взаимодействия белка с основаниями, то в обоих случаях связи предполагаются между одними и теми же АК и нуклеотидами. Из значимых различий отмечу, что nucplot, в отличие от меня, учел три молекулы воды (2 взаимодействуют с фосфорной кислотой и одна с сахаром).

  6. Возможный распознающий контакт

    7. Аминокислоты Arg13 (с нуклеотидами С7 и G8), GLU9 с А9 и His5 с G10. Эти контакты можно считать распознающими, потому что они во-первых локализованы все внутри большой бороздки, во-вторых, остальные аминокислоты контактируют не с основаниями, а с остовом (то есть взаимодействие неспецифично для данной последовательности нуклеотидов). На картинке темно-синим показан фрагмент остова белка, голубым - упомянутые аминокислоты, красным - атомы, контактирующие с ДНК на растоянии меньше 3х Ангстрем (еще одно доказательство в пользу распознающего контакта - очень тесное взаимодействие - значит достаточно прочные связи.)

  7. Характеристика ДНК-связывающего домена P07270 (PHO4_YEAST)

    8. Исследуемый белок содержит классический домен - Basic helix-loop-helix, домен связывания ДНК у эукариот. Этот домен характерен для многих белков - факторов транскрипции и высоко консервативен. Этот домен обеспечивает специфическую димеризацию и облегчает переход неактивных мономеров к активирующим транскрипцию димерам на соответствующих стадиях развития.
    Схема из Pfam

    описание из InterPro - IPR001092 Basic helix-loop-helix dimerisation region bHLH

    На пространственной структуре это выглядит так (домен - зеленый) :