ДНК-белковые комплексы

В этом задании сравнивались реальная и предсказанная вторичные структуры тРНК. Сравнение проведено на примере PDBID 2DXI.

Реальная структура получена и проанализирована в Задании 3 предыдущего практикума при помощи find_pair.

Предсказание же делалось на основе fasta-последовательности тРНК посредством программы einverted и онлайн-сервиса RNAfold^[1].

Программа einverted из пакета EMBOSS позволяет находить инвертированные повторы в структуре нуклеиновой кислоты. На вход подаётся fasta-последовательность и параметры расчёта Score. При использовании значений по умолчанию ничего не было найдено. Поэтому были использованы следующие:

	Gap penalty [12]: 5
	Minimum score threshold [50]: 20
	Match score [3]: 5
	Mismatch score [-4]: -1

На выходе программа einverted дала следующий результат. (Красным дополнительно показаны пары, совпадающие с таковыми в реальной структуре).

	SEQUENCE: Score 59: 17/33 ( 51%) matches, 2 gaps

               1 ggccccatcgtctagcg--gttaggacgcggccct 33
                 | |||||  |   | ||       |   ||||| |
              71 ctggggtcccccttagcttgggggcaaagccggaa 37

Сервис RNAfold использует алгоритм Зукера, который основывается на сравнении свободной энергии структур. На вход так же подаётся fasta-последовательность.

Вывод содержит последовательность в записи формата dot-bracket, в которой "(" и ")" соответствуют 5'- и 3'-основаниям соответственно, а "." обозначает неспаренное основание.

	GGCCCCAUCGUCUAGCGGUUAGGACGCGGCCCUCUCAAGGCCGAAACGGGGGUUCGAUUCCCCCUGGGGUCACCA
	(((((((.(((((........)))))(((((.......)))))....(((((.......))))))))))))....

Помимо текстовой записи мы получаем ещё и графическое изображение предсказанной вторичной структуры, которое может быть дополнительно раскрашено по вероятностям образования пар, а также точечный график c этими вероятностями.

Результат выдачи сервиса в такой форме можно видеть на Рис.1 и Рис.2. Дополнительно на Рис.2 показаны различные стебли и количество пар, совпадающих с таковыми в реальной структуре.

Рис.1. Точечный график вероятностей образования пар

Рис.2. Предсказанная RNAfold вторичная структура c MFE

Результаты сравнения двух предсказанных структур с реальной приведены в Таблице 1.

Участок структуры	Реальные позиции по результатам find_pair	Предсказано пар по einverted	Предсказано пар по алгоритму Зукера
Акцепторный стебель	5'-501-507-3' 5'-566-572-3' 7 пар	6/7 пропущена G-U пара	7/7
T-стебель	5'-549-553-3' 5'-561-565-3' 5 пар	0/5	5/5
D-стебель	5'-510-513-3' 5'-522-525-3' 4 пары	0/4	4/4 имеется лишняя пара G-C, которая отсутствует в реальной структуре из-за неканонического взаимодействия G-А
Антикодоновый стебель	5'-526-532-3' 5'-538-544-3' 7 пар	5/7 пропущены G-A и C-A пары	5/7 пропущены G-A и C-A пары
Общее число канонических пар нуклеотидов	19	11	19

По результатам, представленным в таблице, можно сделать вывод о том, что основной проблемой обоих подходов было затруднение в учёте неканонических взаимодействий, имевших место в реальной структуре. einverted не построил ни одного из четырёх неканонических взаимодействий в стеблях. У RNAfold это вышло лучше: были учтены две G-U пары.

В целом можно сказать, что RNAfold справляется с поставленной задачей намного эффективнее (результат, описанный мною, это результат первой же выдачи программы). Более того, удобство работы с сервисом очевидно: не нужно перенастраивать параметры Score (более того, затруднительно будет проверить на адекватность выдачу einverted, когда вторичная структура будет действительно неизвестна); имеется графическое оформление результатов работы алгоритма.

В этом задании требовалось описать ДНК-белковые контакты различной природы в заданной структуре (PDBID 1BY4). От белка структуры для анализа была взята лишь одна B-цепь.

При написании скрипта использовались следующие соглашения:

• полярными считаются O, N
• неполярными — C, P, S
• полярный ДНК-белковый контакт — ситуация, в которой расстояние между полярным атомом белка и полярным атомом ДНК не превышает 3.5Å
• неполярный ДНК-белковый контакт — аналогично предыдущему пункту для неполярных, расстояние между которыми не превышает 4.5Å

Сперва был создан скрипт с перечнем определений нужных множеств атомов (Script#2a), таких как, к примеру, множество атомов кислорода из остатков фосфорной кислоты, множество углеродов в остатках дезоксирибозы, множество атомов основания, обращенных в большую/малую бороздку, множество полярных и неполярных атомов и т.д.

С ипользованием этого скрипта был написан второй, Script#2b, в котором с помощью команды within были определены множества атомов, вовлеченных в ДНК-белковый контакт, а затем (через group) — соответствующие множества остатков аминокислот или нуклеотидов. Так были получены участки белка и ДНК, на которых происходит образование комплекса.

Итоговый скрипт использовал определенные ранее множества атомов. Помимо этого потребовалось использовать команду, которая бы изобразила все возможные полярные и неполярные контакты, т.е. соединила бы атомы, находящиеся друг от друга на расстоянии не более чем 3.5 или 4.5Å:

	measure RANGE 0 3.5 ALL (atom_expression1) (atom_expression2)

Команда выше отображает все измерения расстояний между атомами вида atom_expression1 и atom_expression2, которые находятся в интервале от 0 до 3.5Å. Для наглядности итоговых изображений числовые результаты измерений можно убрать командой

	set measurements off

В итоге на изображении останутся только пунктирные линии, которые мы и будем рассматривать как ДНК-белковые контакты.

Запустить итоговый скрипт можно в апплете JSmol. Участки структуры, вовлечённые в контакт, изображены в проволочной модели, раскрашены в зелёный (ДНК) или малиновый (белок) цвет. Шариками с раскраской cpk показаны контактирующие атомы.

Апплет JSmol. Контактирующие регионы комплекса ДНК-белок

зелёный: участки ДНК малиновый: участки белка Работа с апплетом: Чтобы начать работу с апплетом, кликните по изображению слева. Для запуска скрипта после загрузки структуры 1BY4 нажмите RUN. Переход к следующему изображению в скрипте осуществляется кнопкой RESUME. Скрипты для скачивания: Script#1 (9 слайдов в апплете) Полярные и неполярные контакты ДНК-белок. Script#2a Задание множеств атомов. Script#2b Определение контактирующих регионов.

Количественный анализ полученных контактов приведён в Таблице 2.

Таблица 2. Контакты различных типов в комплексе 1BY4.pdb

Контакты атомов белка с:	Полярные	Неполярные	Всего
Остатками 2'-дезоксирибозы	0	13	13
Остатками фосфорной кислоты	20	13	33
Остатками оснований со стороны большой бороздки	3	6	9
Остатками оснований со стороны малой бороздки	0	0	0

Как видно из таблицы, со стороны малой бороздки белок никак не контактирует с ДНК, со стороны же большой преобладают неполярные контакты. Больше всего контактов, как полярных, так и неполярных, у белка образовалось с остатками фосфорной кислоты остова ДНК. Это можно объяснить хорошей пространственной доступностью атомов. А вот кислороды дезоксирибозы оказались недоступны для взаимодействий с полярными атомами белка. Остатки сахаров были намного более склонны к образованию неполярных контактов между углеродом сахара и неполярным атомом белка.

Получение популярной схемы ДНК-белковых контактов

Для анализа ДНК-белкового комплекса и получения графического изображения результатов использовалась программа nucplot. Для работы с ней требовалось перевести файл [pdb] в старый формат с помощью remediator:

	remediator --pdb --old file.pdb > old_file.pdb

Синтаксис nucplot:

	nucplot old_file.pdb

На выходе получали файл-изображение nucplot.ps, который для удобства нужно было конвертировать в [png]-формат:

	convert PS:nucplot.ps PNG:nucplot.png

Выдачей программы convert послужили 4 файла: nucplot-0.png, ..., nucplot-4.png. Они приведены на Рис.2

Рис. 2. Изображение ДНК-белковых контактов в nucplot

Таким образом очень удобно анализировать соотношение остатков аминокислот белка, участвующих в контакте c ДНК. Для получения более полного представления анализировались контакты ДНК не только с цепью В белка, но и целиком. Итоги приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Вклад различных аминокислот в образование комплекса с ДНК

Остаток аминокислоты	Участие в контактах ДНК и всего белка	Участие в контактах ДНК и цепи B белка
ARG	31	6
HIS	15	3
GLN	12	5
LYS	9	2
GLU	8	1
ASN	6	3
TYR	2	1
PHE	2	0
GLY	1	0
VAL	1	0

Одной из причин того, что аргинин так часто участвует в контактах с ДНК, может быть его положительный заряд, который притягивается к отрицательно заряженному (заряд остатков фосфорной кислоты) остову спирали ДНК. Аналогичные рассуждения применимы к объяснению относительно высоких частот встречаемости лизина и гистидина.

После рассмотрения схемы nucplot можно предположить, что аргинин и глутамин — одни из важнейших остатков в распознавании ДНК. Дело в том, что, в отличие от других аминокислот, они способны к специфичному связыванию именно азотистых оснований (аргинин предпочтительно связывается с гуанином, а глутамин — с аденином), несмотря на стерические ограничения (расположение оснований внутри спирали). А гистидин, к примеру, хоть и вносит количественно большой вклад в ДНК-белковое взаимодействие, контактирует только с остатками фосфорной кислоты, доступ к которым никаких особых затруднений не вызывает. Следовательно, речь идет о неспецифическом связывании.

Механизм специфического узнавания гуанина остатком аргинина^[2]. Аргинин обладает такими замечательными свойствами как (I)достаточная длина цепи (позволяет преодолевать стерические ограничения и подбираться вплотную в основаниям), (II)возможность образования не только монодентатных, но и бидентантых комплексов с гуанином. Здесь стоит отметить, что эта возможность резко повышает уровень специфичности узнавания аргинином гуанина. Это происходит потому, что обычно связи образуются с N7 или O6 атомами гуанина. Но, как известно, N7 атом есть и у аденина. Поэтому остатки, не способные обеспечить образование бидентатного комплекса и взаимодействующие только с N7, не различают между собой эти пуриновые основания.

Сказанное выше применимо и к глутамину, склонному к образованию бидентатных комплексов с аденином (N6, N7 атомы аденина).

На Рис. 3 и Рис. 4 проиллюстрированы контакты остатков аргинина с ДНК через связь с гуанином по N7-типу (с образованием монодентатного комплекса).

Рис. 3

Вид сверху. Пунктирной линией показан контакт ДНК с аргинином. ДНК (зеленый) и белок (малиновый) показаны в проволочной модели. Боковые цепи скрыты. Основание [DG]1533 и остаток аминокислоты [ARG]1261 раскрашены по cpk.

Рис. 4

Вид сверху. Пунктирной линией показан контакт ДНК с аргинином. ДНК (зеленый) и белок (малиновый) показаны в проволочной модели. Боковые цепи скрыты. Основание [DG]1533 и остаток аминокислоты [ARG]1261 представлены с учётом ван-дер-ваальсовых радиусов и раскрашены по cpk.

На Рис. 5 и Рис. 6 показано взаимодействие глутамина с ДНК через остаток фосфорной кислоты.

Рис. 5

Пунктирной линией показан контакт ДНК с глутамином. ДНК (зеленый) и белок (малиновый) показаны в проволочной модели. Боковые цепи скрыты. Основание [DT]1532 и остаток аминокислоты [ARG]1288 раскрашены по cpk.

Рис. 6

Вид сверху. Пунктирной линией показан контакт ДНК с аргинином. ДНК (зеленый) и белок (малиновый) показаны в проволочной модели. Боковые цепи скрыты. Основание [DG]1533 и остаток аминокислоты [GLU]1288 представлены с учётом ван-дер-ваальсовых радиусов и раскрашены по cpk.