Семестр 2

EMBOSS

1. Программа getorf пакета EMBOSS

Создадим файл с записью D89965 банка EMBL, для этого воспользуемся командой:

entret embl:D89965 -auto

Получаем файл d89965.entret с полной записью D89965, в которой, как оказалось, содержится последовательность матричной РНК мужской особи Rattus norvegicus, полученной из клеток тканей желудка. Для того, чтобы получить набор трансляций всех открытых рамок считывания этой последовательности,которые определены при использовании стандартного кода, с длиной не менее 30 аминокислотных остатков, начинающихся со старт-кодона и заканчивающиеся стоп-кодоном, используем программу getorf с определенными параметрами:

-minsize 90 задает минимальную длину нуклеотидной последовательности, по условию нам необходимо получить последовательности длиной не менее 30-и аминокислот, зная, что одна аминокислота кодируется триплетом, задаем минимальную длину открытой рамки считывания 90 нуклеотидов;
-find 1 задает начало и конец трансляции, в данном случае транслируемый участок начинается со старт-кодона и заканчивается стоп-кодоном;
-table 0 позволяет выбрать тип генетического кода из множества вариаций, в данном случае используется стандартный генетический код;
Таким образом, запускаем команду:
```
getorf d89965.entret -minsize 90 -find 1 -table 0
```
Получаем файл d89965.orf с пятью открытыми рамками считывания. Замечаем, что третья рамка практически полностью соответствует приведенной в поле FT кодирующей последовательности (CDS). Убедиться в этом можно, посмотрев на вырезки из записей, полученных ранее:
```
>D89965_3 [163 - 432] Rattus norvegicus mRNA for RSS, complete cds.
	MALMHFQFTFKQFEQRKSIRSTARKARDDFVVVQTADLFHVAFHYGIAQRGLTITSDDHM
	AVTAYAYYSCHELTPWLRIQSTNPVQKYGA
```
```
FT   CDS             163..435
FT                   /product="RSS"
FT                   /note="Rat Stomach Serotonin receptor-related gene"
FT                   /db_xref="GOA:P0A7B8"
FT                   /db_xref="InterPro:IPR001353"
FT                   /db_xref="InterPro:IPR022281"
FT                   /db_xref="PDB:1E94"
FT                   /db_xref="PDB:1G4A"
FT                   /db_xref="PDB:1G4B"
FT                   /db_xref="PDB:1HQY"
FT                   /db_xref="PDB:1HT1"
FT                   /db_xref="PDB:1HT2"
FT                   /db_xref="PDB:1NED"
FT                   /db_xref="PDB:4G4E"
FT                   /db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P0A7B8"
FT                   /protein_id="BAA14040.1"
FT                   /translation="MALMHFQFTFKQFEQRKSIRSTARKARDDFVVVQTADLFHVAFHY
FT                   GIAQRGLTITSDDHMAVTAYAYYSCHELTPWLRIQSTNPVQKYGA"
```
Запись EMBL d89965.entret ссылается на запись P0A7B8 Swiss-Prot, поэтому с помощью команды seqret получим последовательность записи Swiss-Prot:
```
seqret sw:P0A7B8
```
Поулчаем файл hslv_ecoli.fasta с последовательностью белка HSLV_ECOLI. Заметим, что эта последовательность соответствует пятой рамке считывания:
```
>HSLV_ECOLI P0A7B8 ATP-dependent protease subunit HslV (3.4.25.2) (Heat shock protein HslV)
MTTIVSVRRNGHVVIAGDGQATLGNTVMKGNVKKVRRLYNDKVIAGFAGGTADAFTLFEL
FERKLEMHQGHLVKAAVELAKDWRTDRMLRKLEALLAVADETASLIITGNGDVVQPENDL
IAIGSGGPYAQAAARALLENTELSAREIAEKALDIAGDICIYTNHFHTIEELSYKA
```
```
>D89965_5 [294 - 1] (REVERSE SENSE) Rattus norvegicus mRNA for RSS, complete cds.
MKGNVKKVRRLYNDKVIAGFAGGTADAFTLFELFERKLEMHQGHLVKAAVELAKDWRTDR
MLRKLEALLAVADETASLIITGNGDVVQPENDLIAIGS
```
Как же так получается, что запись с мРНК крысы ссылается на запись с последовательностью белка кишечной палочки? Это можно объяснить тем, что эти бактерии являются частью нормальной флоры кишечника как человека, так и животных, поэтому вполне возможно, что во время эксперимента была отсеквенирована последовательность гена кишечной палочки и по ошибке принята за ген крысы.

2. Файлы-списки

С помощью программ пакета EMBOSS:
1. Скачаем в файл adh.fasta в fasta-формате все доступные в Swissprot последовательности алкогольдегидрогеназ.
```
seqret sw:adh*_* adh.fasta
```
2. Далее получим файл с универсальными адресами (USA) этих последовательностей.
```
infoseq adh.fasta -usa -only >> usa.txt
```
3. Получим из этого файла-списка другой, меньший, с адресами только тех последовательностей, которые взяты из предложенных мне организмов: organism.txt.
```
grep -f organism.txt usa.txt >> usa_grep.txt
```
4. На основе нового файла-списка получим fasta-файл с последовательностями дегидрогеназ моих организмов.
```
seqret @usa_grep.txt mysequences.fasta
```
  Таким образом, имеем файл с последовательностями алкогольдегидрогеназ предложенных организмов: mysequences.fasta.
3. EnsEMBL

Портал EnsEMBL предназначен для визуализации известной информации о геномах человека и животных. Для начала поищем информацию о гене, кодирующем белок EST1A_HUMAN, введя идентификатор в поле поиска. В итоге получаем пять результатов, один из них - это сам ген, а остальные - транскрипты. Если перейти по ссылке, соответствующей гену, мы увидим подробную информацию о нем, включая краткое описание, хромосому, в которой локализован этот ген и точные координаты. Также слева есть колонка с ссылками на дополнительную информацию о гене, перейдя по некоторым из них мы можем увидеть последовательность гена с выделенными экзонами, узнать об экспрессии гена в клетках разных тканей, также узнать о паралогах и ортологах и их представленности в разных организмах. В этой колонке также можно обнаружить опцию Export Data, которая позволяет скачать последовательность гена со всеми экзонами, что мы и делаем:ENSG00000070366.fasta.

Далее привычным нам способом, а именно с помощью пакета EMBOSS, получим последовательность гена, кодирующего белок EST1A_HUMAN:ay145883.fasta.

А теперь попробуем воспользоваться сервисом "BLAST/BLAT", поищем ген AY145883. В результате на странице появляются три поля и первое из них Alignment Locations vs. Karyotype(рис.1). Здесь мы можем увидеть расположение искомого гена в геноме человека. В данном случае он расположен на 17-ой хромосоме и обведен красной рамкой.

Рис.1. Расположение гена AY145883 в геноме человека.

Следующее поле называется Alignment Locations vs. Query(рис.2). Как я поняла, здесь изображено выравнивание нашего фрагмента с геномом человека.

И наконец третье поле Alignment Summary(рис.3), в котором представлена полная информация о выравнивании. Эта таблица хороша тем, что мы сами можем выбирать параметры, значения которых будут отображаться.Рассмотрим столбец links подробнее. Он состоит из трех колонок:
1. [A](Aligment) - ведет к выравниванию фрагмента с геномом человека, также в это разделе указывается длина и вес выравнивания, e-value и процент идентичности;
2. [G]((Genome Sequence) - предоставляет информацию о самом выровненном участке, то есть о его последовательности, также есть возможность задать длину фланкирующих последовательностей;
3. [C](Contig view) - перейдя по этой ссылке, мы попадаем в раздел "Region in detail". Здесь можно увидеть расположения гена на хромосоме(рис.4), более подробное описание области с геном(рис.5), включая контиги(на рис.5 подписаны и выделены голубым или синим цветом) и окружающие гены, также локус гена(рис.6).
Рис.3.

Рис.4.

Рис.5.

Рис.6.

© Evstafyeva Diana, 2013