Чтение последовательностей по Сэнгеру

По результатам хроматограмм из капиллярного секвенатора по Сэнгеру и последовательности, сгенерированной программой, получить последовательность фрагмента ДНК

прямая цепь	обратная цепь
WS1947_COI_F_F11_WSBS-Seq-4-08-15.ab1	WS1947_COI_R_F12_WSBS-Seq-4-08-15.ab1
Ссылка на скачивание	Ссылка на скачивание

»Выравнивание последовательностей
»Цепь ДНК

В программе Chromas (Lite) были выровняны относительно друг друга хроматограммы прямой и обратной цепей ДНК. С помощью команды reverse + complement была получена реверсированная последовательность, комплементарная обратной. Команда find отмечала одинаковые участки в двух последовательностях, с ориентировкой на которые затем строилось выравнивание в программе Jalview.
После того, как основная часть двух последовательностей выравнена, необходимо обратить внимание на участки несоответствия. Так на участке 109 - 115 (отсчёт оснований по выравненной цепи ДНК) наблюдается пятно краски на хроматограмме прямой цепи (Рис.1). На обратной же цепи этот участок сомнений не вызывает.
На участке 150 - 151 на прямой цепи помехи мешают различить сигналы от оснований, а на обратной помех нет.

Рис.1.

Также в последовательностях было несколько мест, где программа поставила "N" (т.е. неопределённый нукеотид) над некоторым нуклеотидом, а все его соседи определены. Это связано с тем, что сигнал от нуклеотида хоть и враже, но не сильно превосходит уровень шума, который по какой-то причине проявился на месте конкретного нуклеотида и отличается от общего уровня шума (Рис.2, 3, 4).


Рис.2.	Рис.3.	Рис.4.

Такое изображение может свидетельстввать о существовании полиморфизма для данных нуклеотидов. Хотя в случаях на рисунках 2 и 3 такое маловероятно, поскольку рядом есть пики шума сравнимой высоты. На рисунке 4 также наблюдаются дргие сравнительно большие шумы рядом с позицией "N", но здесь помимо этого есть довольно большой пик гуанина, перекрывающийся с тимином 381, по высоте сравнимый с другими пиками гуанина.Можно предположить, что в позиции 381 сссуществует полиморфизм, выражающийся в замене тимина на гуанин.

Начало прямой цепи (Рис.5) и конец обратной (Рис.6) явяются нечитаемыми, поскольку секвенировались в начале. Эти концы необходимо удалить, так как никакой информации они не несут.
Координаты нечитаемых концов (по прямой последовательности):
Начало: 0 - 16
Конец: 653 - 702
Хотя программа уже не определяет некоторые основания до 653 на обратной последовательности, но визуально их можно различить, и они совпадают с таковыми на прямой.


Рис.5.Начало	Рис.6.Конец

В целом, хроматограмма имеет довольно высокое качество, поскольку сила шума была не сравнима с силой сигнала, пики сигнала разделены и хорошо выражены. Однако было одно пятно краски на прямой цепи и сложно определяемый участок близко к концу обратной цепи.

Рассмотрим нечитаемый участок и выясним, почему нельз извлечь из него информацию.

Рис.7.

По цвету можно определить, сигнал какого нуклеотида наблюдается на хроматограмме. Но выяснить, в какой последовательности они идут не представляется возможным, поскольку одни пики леат поверх других.Также нельзя разобрать, сигнал скольки тиминов изображён на участках 683 - 690 и 698 - 716, так как пики не разделены. К тому же, невозможно разобрать, какой сигнал яляется шумовым, а какой истинным, ведь все сигналы одного уровня. Всё, что можно заключить из этой хроматограммы, это то, что в этом участке ДНК есть аденин, тимин, цитозин и гуанин, но для анализа последовательности эта информация не имеет практического смысла.

«Назад
Дальше»