Назад
Страница второго семестра

Язык:

Скелеты в тулупах с красной звездой
Седлают оленей козлиной ногой.
На них с любопытством смотрел оцелот,
Пока не устроился в Аэрофлот.
Кобыла и трупоглазые жабы, "Азиатский Способ Производства"

Атлас контактов белка 4DKL

1. Вступление

**Рисунок 1.** 4DKL. Изображение взято из PDB.

μ-опиоидный рецептор — рецептор эндогенных опиоидов, таких как бета-эндорфин и морфин. Связывание агониста с рецептором индуцирует связывание с неактивным связанным с ГДФ тримерным комплексом G-белка и последующий обмен ГДФ на ГТФ в альфа-субъединице G-белка, приводящий к диссоциации комплекса G-белка на свободный ГТФ-связанный G-белок (альфа) и бета-гамма-димер G-белка, активирующий нижестоящие клеточные каскады^[1,2]. Рецептор опосредует целый ряд клеточных ответов «ниже по течению», включая ингибирование активности аденилатциклазы и кальциевых каналов, активацию МАР-киназы^[3-5], фосфолипазы C, регуляцию NF-κB^[3-5] и многие другие^[6]. Фосфорилирование Ser/Thr протеинкиназами и связь с β-аррестинами участвует в кратковременной десенсибилизации рецептора. β-аррестины связываются с фосфорилированным рецептором и отсоединяют его от G-белка, тем самым прекращая передачу сигнала^{[6, 7]}. Эндогенные лиганды вызывают быструю десенсибилизацию, эндоцитоз и рециркуляцию, тогда как морфин вызывает только низкую десенсибилизацию и эндоцитоз^[6-8]. Показано, что рецептор участвует в нейрогенезе^[9].
Кристаллизованный белок представляет собой димер из одинаковых субъединиц. По сравнению с углубленным карманом связывания, наблюдаемым в большинстве опубликованных к настоящему времени рецепторов, связанных с G-белками, лиганд глубоко связывается в большом, открытом кармане^[2].

2. Лиганды

Просмотреть контакты лигандов с белком можно в апплете, выбрав соответствующий лиганд в выпадающем меню.

**Таблица 1.** Лиганды 4DKL. Нажмите на изображение структурной формулы лиганда, чтобы увидеть шаро-стержневую модель. Чтобы скрыть шаро-стержневую модель, нажмите повторно. Информация взята из PDB
Лиганд	Химическая формула	Брутто-формула	Название в номенклатуре IUPAC	Молярная масса, г/моль	Индикатор PubChem
SO4		SO₄	SULFATE ION	96.07	1117
Cl		Cl	CHLORIDE ION	35.45	312
MPG		C₂₁H₄₀O₄	[(Z)-octadec-9-enyl] (2R)-2,3-bis(oxidanyl)propanoate	356.5	17754086
BF0		C₂₅H₃₂N₂O₆	methyl 4-{[(5beta,6alpha)-17-(cyclopropylmethyl)- 3,14-dihydroxy- 4,5-epoxymorphinan-6-yl]amino}-4-oxobutanoate	456.5	137348997
1PE		C₁₀H₂₂O₆	PENTAETHYLENE GLYCOL	238.28	62551
CLR		C₂₇H₄₆O	CHOLESTEROL	386.7	5997

Выберите в выпадающем меню под апплетом скрипт, который хотите запустить |

3. Межбелковые контакты

3.1. Ковалентные связи

Для нахождения дисульфидных мостиков были выделены все цистеины белка, после был произведен ручной поиск цистеинов, образующих ковалентную связь.
При рассмотрении структуры белка был найден один цистиновый мостик, образованный остатками цистеина Cys 140 и Cys 217. Увидеть его можно в апплете, выбрав скрипт «Цистиновый мостик». Данная связь стабилизирует внеклеточный участок белка, оставляя открытым центр связывания.

3.2. Водородные Связи

Поиск водородных связей в белке производился через выделение всех атомов белка, не входящих во вторичные структуры, с последующим расчетом водородных связей.
Белок, в целом, имеет большое количество альфа-спиралей, которые поддерживаются водородными связями. Помимо водородных связей, служащих для поддержания вторичной структуры, существуют также водородные связи между боковыми радикалами аминокислот: например, между треонином Thr 1054 и валином Val 1057, между аспарагином Asn 1020 и тирозином Tyr 1024 (всего водородных связей вне вторичных структур 14). Также в объекте существует водородная связь между боковыми радикалами треонинов обоих цепей (белок представляет собой димер). Эти водородную связь можно увидеть в апплете, выбрав скрипт «Водородные связи». Параметры этих связей (Таблица 2) соответствуют общепринятым^{[12, 13]}.
Функциональная роль связи между треонинами может состоять в стабилизации структуры димера.

**Таблица 2.** Параметры водородных связей
Взаимодействующие аминокислоты	Атомы-участники водородной связи	Длина, Å	Угол, градусы
Thr 249:1 - Thr 249:2	O - O	2.6	134.5
Thr 1054 - Val 1057	O - N	3.2	145
Asn 1020 - Tyr 1024	N - O	2.8	142.8
Asn 1020 - Tyr 1024	O - N	2.4	111.7

3.3. Солевые мостики

**Рисунок 2.** Гипотетический ионный мостик между глутаматом(справа) и аргинином, боковая цепь которого отсутствует в PDB-файле.

Поиск солевых мостиков производился при выделении всех заряженных аминокислот в белке с последующим рассчетом расстояний для определения возможности появления между этими двумя аминокислотами солевого мостика.
Подробное изучение структуры данной биомолекулы позволило нам найти два солевых мостика между глутаматом Glu 341 и лизином Lys 344, между глутаматом Glu 229, лизином Lys 233, между глутаматом Glu 270 и аргинином Arg 263, между глутаматом Glu 1128 и аргинином Arg 1125. Расстояния между атомами, стремящимися образовать мостик (N аминогруппы лизина или аргинина и O гидроксильной группы глутамата), представлены в Таблице 3 — отметим, что боковая цепь аргинина 263 (его солевой мостик образован между мономерами димера) почему-то отсутствует в PDB-файле, но скорее всего она будет образовывать солевой мостик с глутаматом Glu 270, потому что даже между ꞵ-углеродом аргинина и кислородом боковой цепи глутамата расстояние 3.29 ангстрем (Рис. 3). Полученные длины соответствуют уже установленным данным^{[14, 15]}. Просмотреть солевой мостик можно в апплете при выборе скрипта «Солевые мостики». Каждому солевому мостику 1-4 из таблицы 3 свойственна своя функция: первый стабилизирует спираль, в которой находится, после её поворота; второй просто её стабилизирует; функция третьего мостика — правильное ориентирование своей спирали, а четвертого — связь между субъединицами.

**Таблица 3.** Расстояния в солевых мостиках
	Остатки, формирующие мостик	Расстояние, Å
1	Glu 341 - Lys 344	3.5 и 2.9
2	Glu 229 - Lys 233	3.2
3	Glu 1128 - Arg 1125	3.5 и 2,8
4	Glu 270/1 - Arg 263/2	<3.3

3.4. Гидрофобное слипание

Поиск гидрофобных контактов оказался самым простым, так как после выделения всех гидрофобных аминокислот стало очевидно, что они образуют между собой массивный кластер слипания.
Поскольку рецептор является трансмембранным и димерным, резонно предположить, что основная его масса будет представлена гидрофобными аминокислотами. Такое предположение подтверждается при просмотре гидрофобных аминокислот и их контактов в JMol. В области контакта двух субъединиц также содержится множество аминокислот, которые также присутствуют и за пределами трансмембранной части. Скорее всего это гидрофобное взаимодействие и является ключевым в четвертичной структуре белка. Оно может быть продемонстрировано в апплете при выборе скрипта «Гидрофобное слипание».

Выберите в выпадающем меню под апплетом скрипт, который хотите запустить |

4. Гидрофобное ядро

В качестве демонстрационного аминокислотного остатка был выбран фенилаланин Phe 1153.
Прогнав скрипт в третьем апплете, можно увидеть, что расстояние в 7 ангстрем является минимальным для полного сокрытия аминокислоты в других атомах. В среднем, характерное расстояние между ядрами соседних не связанных ковалентно атомами в белке не больше, чем 6.1 ангстрем, т.е. в такое расстояние не поместится молекула воды, поскольку расстояния между поверхностями атомов не больше 2.2Å, а диаметр атома кислорода составляет 2.8Å^[16]. Однако, вблизи атома серы метионина Met 1102 существует просвет(Рис.3), который ничто не занимает и который вполне может вместить одну молекулу воды.

область без атомов — **Рисунок 3.** Пространство без атомов.

Чтобы активировать апплет, нажмите сюда, или на кнопку "гидрофобное ядро" под апплетом | Текст скрипта

5. Трансмембранность

Белок относится к семейству рецепторов, связанных с G-белком. Согласно предсказанию TMHMM(Рис. 4), у него 7 трансмембранных участков в виде альфа-спиралей, находящихся N-концом наружу. Расположение белка по аминокислотам можно увидеть в Таблице 4. Видно, что у белка есть внутренние, внешние и трансмембранные домены. Очевидно, что внутриклеточные домены нужны рецепторы для связи с G-белками. Также, участок белка с 206 по 384 аминокислоту является самым большим по протяженности из внутриклеточных, а значит, скорее всего является участком связи с G-белками. Энергия ассоциации всех трансмембранных альфа-спиралей (т.е. энергетических выигрыш процесса их ассоциирования) −65 kcal\mol, что является энергетически выгодным. Поэтому белок компактно располагается в мембране.

**Таблица 4.** Распределение белка вокруг мембраны. Всего в мембрану погружено 152.5 остатка.
Вне клетки	1- 19				77- 90				156- 182				405- 418
Трансмембиранное пространство		20- 42		54- 76		91- 112		135- 155		183- 205		385- 404		419- 441
Внутри клетки			43- 53				113- 132				206- 384				442- 464

Изображения визуализации положения белка в мембране из разных баз данных. Синий слой внутренний.

← OPM MemProt GLMol PDBTM →

Вклад авторов

Дмитрий Босов: скрипты апплета (лиганды), смог сформулировать неоценимый вклад Евгения Егорова. Перевод на язык эмодзи.

Евгений Егоров: большая часть работы выполнена тренером нашего состава по киберспортивной дисциплине Dota 2. Сложно выделить какие-то ключевые моменты в его деятельности, так как любой его совет направлял нас в верное русло. Мы долго не могли понять как двигаться по карте. Именно его качественный анализ — просмотр всех наших соло матчей (со случайными игроками в обычном игровом режиме) и также наши командные игры. Он дал нам множество советов, касательно этого аспекта, к ним относятся:
– расстановка линий: именно он расставил роли. Объяснил нам, что керри должен идти на легкую линию, а не в лес.
– объяснил саппортам, особенно 4-ке — Артемию (далее Шейкеру) о особенностях перемещения по карте в первые минуты игры.
– показал нам на важность хождения впятером после стадии лайнинга (от англ. line — линия).
Он разбирал с нами не только макро, но и наши микро. Уверенно подмечал все ошибки. Мы были уверены, что эти ошибки свойственны даже тир-1 игрокам, но на это заявление он просто показал нам EvilArthas, величайшего игрока в Dota 2.
Это самый лучший игрок, идеально чувствующий игровую ситуацию. Он способен выиграть игру в соло (от англ. solo — в одиночку). Помимо весьма качественного анализа игровой ситуации, он никогда не принижает свой вклад в игру. Именно он доказал существование «скрытого пула» на своём примере.
Артас (EvilArthas) смотря профессиональные матчи (The International) отметил, что в игре важны 3 аспекта: первый и самый важный — пик (от англ. pick — выбирать), второй — командное взаимодействие, и третье — личный скилл игрока(умение вовремя нажать БКБ и как говорил сам EvilArthas: «БКБ купил, прожать не купил»).
Непросто так была упомянута стадия пиков — именно над ней Евгений Егоров работал большую часть времени. У нас есть множество связок героев, благодаря его советам по выбору персонажей мы уверенно отстаиваем линии.
Самые важные советы Тренера:
– Не пикать Pudge
– Банить Techies и Pudge
– Пикать Rubick саппорта в 2045 — быть дауном (в этом также уверен EvilArthas)
– Legion Commander — худший герой (Лучшая внешне, худшая на деле)
– Shadow Fiend проигрывает мид уже как 10 лет
Помимо определения слабых героев Тренер также выделяет Wraith King, Luna, Windranger.
Сложно даже предположить, где бы мы были, если бы нас не согласился тренировать Евгений Егоров. Мои споры с саппортом Владимиром Н. периодически доходили до драк, но благодаря Тренеру это прекратились. Когда он пришёл к нам, мы были на гране распада: вечный скрытый пул, не понимая в команде, плохая отыгровка от Phantom Lancer; но он, в соляного, сумел нас настроить, раскрыть скрытый потенциал каждого из нас. Он был не просто Тренером — он был психологом.
Нам не удалось попасть на первые квалификации Major из-за контрольной по химии, хотя безусловно, мы были топ-1 СНГ. Помимо химии, мы прекрасно понимали, что если бы мы поехали в Чэнду (Китай), то пропустили бы коллоквиум по математическому анализу (хорошо что мы учли это и сделали выбор в пользу Na’Vi (дали им шанс пройти)).
Помнится, он рассказал мне, как правильно стоять хардлайн на Windranger. Я понял, что до этого допускал множество ошибок и не представлял что нужно делать. Он указал Артемию П. как играть на Earthshaker. После его гайда я не удивлюсь, что Артемий даст свой Echo Slam на миллион долларов ( это отсылка к The International 2016, когда EG — североамериканская команда — в решающей драке на рошане выдали свою связку: Echo Slam + Ice Blast, убив всю команду противника).
Логичный вопрос: как всё это относится к Атласу контактов?
Знаете, всё рассказанное выше никак не относится к Атласу контактов, Евгений Егоров просто хороший тренер. На самом деле если бы не его опыт, мы бы вряд ли организовались и так слаженно сделали эту работу.

Владимир Ноздрин: поиск межбелковых взаимодействий, скрипты апплетов (межбелковые взаимодействия, гидрофобное ядро), сопровождение отчета скриншотами из JMol, создание веб-страницы с отчётом.

Артемий Пигиданов: работа с TMHMM, получение изображения белка в мембране с помощью соответствующих сервисов, выводы о функциональной принадлежности найденных межбелковых контактов.

Даниил Хлебников: текст отчёта (Ru + En), описание полученных результатов, поиск водородных связей.

Список литературы

Wang JB, Johnson PS, Persico AM, Hawkins AL, Griffin CA, Uhl GR: Human mu opiate receptor. cDNA and genomic clones, pharmacologic characterization and chromosomal assignment. FEBS Lett. 1994 Jan 31;338(2):217-22.
Aashish Manglik, Andrew C. Kruse, Tong Sun Kobilka, Foon Sun Thian, Jesper M. Mathiesen, Roger K. Sunahara, Leonardo Pardo, William I. Weis, Brian K. Kobilka, and Sébastien Granier: Crystal structure of the μ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. ; 485(7398): 321–326.
Suzuki S, Chuang LF, Yau P, Doi RH, Chuang RY: Interactions of opioid and chemokine receptors: oligomerization of mu, kappa, and delta with CCR5 on immune cells. Exp Cell Res. 2002 Nov 1;280(2):192-200.
Law PY, Wong YH, Loh HH: Molecular mechanisms and regulation of opioid receptor signaling. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2000;40:389-430.
Chuang TK, Killam KF Jr, Chuang LF, Kung HF, Sheng WS, Chao CC, Yu L, Chuang RY: Mu opioid receptor gene expression in immune cells. Biochem Biophys Res Commun. 1995 Nov 22;216(3):922-30.
Onoprishvili I, Andria ML, Kramer HK, Ancevska-Taneva N, Hiller JM, Simon EJ: Interaction between the mu opioid receptor and filamin A is involved in receptor regulation and trafficking. Mol Pharmacol. 2003 Nov;64(5):1092-100
Mestek A, Hurley JH, Bye LS, Campbell AD, Chen Y, Tian M, Liu J, Schulman H, Yu L: The human mu opioid receptor: modulation of functional desensitization by calcium/calmodulin-dependent protein kinase and protein kinase C. J Neurosci. 1995 Mar;15(3 Pt 2):2396-406.
Massotte D, Brillet K, Kieffer B, Milligan G: Agonists activate Gi1 alpha or Gi2 alpha fused to the human mu opioid receptor differently. J Neurochem. 2002 Jun;81(6):1372-82.
Jin J, Kittanakom S, Wong V, Reyes BA, Van Bockstaele EJ, Stagljar I, Berrettini W, Levenson R: Interaction of the mu-opioid receptor with GPR177 (Wntless) inhibits Wnt secretion: potential implications for opioid dependence. BMC Neurosci. 2010 Mar 9;11:33. doi: 10.1186/1471-2202-11-33.
Gris P, Gauthier J, Cheng P, Gibson DG, Gris D, Laur O, Pierson J, Wentworth S, Nackley AG, Maixner W, Diatchenko L: A novel alternatively spliced isoform of the mu-opioid receptor: functional antagonism. Mol Pain. 2010 Jun 2;6:33.
Pan YX, Xu J, Mahurter L, Xu M, Gilbert AK, Pasternak GW: Identification and characterization of two new human mu opioid receptor splice variants, hMOR-1O and hMOR-1X. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Feb 21;301(4):1057-61
Jeffrey, George A., An introduction to hydrogen bonding, Oxford University Press, 1997.
Elangannan Arunan, Gautam R. Desiraju, Definition of the hydrogen bond (IUPAC Recommendations 2011).
Bosshard, H. R., Marti, D. N., & Jelesarov, I. (2004). Protein stabilization by salt bridges: concepts, experimental approaches and clarification of some misunderstandings. Journal of Molecular Recognition, 17(1), 1–16.
Barlow DJ, Thornton JM. 1983. Ion pairs in proteins. J. Mol. Biol. 168: 867–885.
Эмсли Дж. Элементы. (The Elements, 1991). Перевод с английского Е.А. Краснушкиной. Справочно-энциклопедическое издание.(Москва: Издательство «Мир». Редакция литературы по химии, 1993)