Учебный сайт Левина Ильи, 3-й семестр

A- и В- формы ДНК. Структура РНК

Задание 1

Построить модели структур A-, B- и Z-формы ДНК с помощью инструментов пакета 3DNA.

Для выполнения этого задания я использовал программу fiber. Команды, с помощью которых я эти структуры построил, вместе с выходом в консоль выглядели вот так:

lewis@kodomo:~/term3/block1/pr2$ fiber -seq=GATCGATCGATCGATCGATC -a gatc-a.pdb
Structure #1; Twist: 32.7 (degrees); Rise: 2.548 (Angstrom)
lewis@kodomo:~/term3/block1/pr2$ fiber -seq=GATCGATCGATCGATCGATC -b gatc-b.pdb
Structure #4; Twist: 36.0 (degrees); Rise: 3.375 (Angstrom)
lewis@kodomo:~/term3/block1/pr2$ fiber -seq=GATCGATCGATCGATCGATC -z gatc-z.pdb
Structure #15; Twist: -60.0 (degrees); Rise: 7.250 (Angstrom)
Repeating unit: GC:GC
Number of repeats (Dft: 10):

Количество повторений в 3-й команде я решил оставить по умолчанию.

Получившиеся файлы: gatc-a.pdb, gatc-b.pdb, gatc-z.pdb.

Задание 2

Сравнение сгенерированных структур 3-х форм ДНК с со структурами той же формы, полученными в результате эксперимента.

Таблица 1. Сравнение структур ДНК
Форма ДНК A-форма B-форма Z-форма
Способ получения Сгенер. Эксперим. Сгенер. Эксперим. Сгенер. Эксперим.
Закрученность спирали Правая Правая Правая Правая Левая Левая
Шаг спирали (Å) 28.03 (29:B.P - 40:B.P) 31.18 (2:B.P - 13:B.P) 33.75 (1:A.P - 11:A.P) 30.08 (2:A.P - 12:A.P) 37.82 (22:B.P - 33:B.P) -
Число оснований на виток 12 12 10 11 12 -
Ширина большой бороздки (Å) 7.98 (5:A.P - 30:B.P) 11.21 (5:A.P - 4:B.P) 17.21 (9:A.P - 29:B.P) 16.44 (7:A.P - 22:B.P) 9.87 (13:A.P - 32:B.P) 11.43 (4:A.P - 10:B.P)
Ширина малой бороздки (Å) 16.81 (13:A.P - 30:B.P) 15.17 (5:A.P - 13:B.P) 11.69 (9:A.P - 36:B.P) 11.06 (7:A.P - 22:B.P) 14.73 (10:A.P - 32:B.P) 15.72 (3:A.P - 9:B.P)

Замечание 1: предоставленная экспериментальная струкутура настолько коротка, что ни одна из её цепей не достигает в длину хотя бы одного витка. Только половина. Из-за этого пощитать шаг спирали и число оснований на виток для экспериментально добытой ДНК Z-формы (PDB ID: 1TNE) крайне затруднительно (невозможно).

Замечание 2: стоит отметить, что в сравнении экспериментально полученной ДНК и сгенерированной ДНК большая часть данных не отличается более чем на 3.5Å, что я считаю полностью приемлемым на фоне общего размера дуплексов ДНК.

Также в структуре 1BNA я выбрал себе 7-й тимин (который мне задали в прошлом практикуме) в А-цепи и определил, какие атомы в сторону какой бороздки обращены:

Атомы, которые обращены в сторону большой бороздки, на рисунке показаны красным, а атомы, которые обращены в сторону малой бороздки, на рисунке показаны синим. Нумеровались атомы на рисунке в соответствии с их номерами в файле PDB. Само изображение было создано с помощью MarvinSketch.

thymine.jpg

Задание 3

Определение параметров структур нуклеиновых кислот с помощью программ пакета 3DNA.

Всем этим измерениям я подверг структуру 1GTS.pdb.

Скачал я её с помощью скрипта, написанного на Python ещё во 2-м блоке 1-го семестра обучения: pdbfetch.py. Запустил я его с помощью команды:

python3 ~/term1/block2/homeworks/pr9/pdbfetch.py 1gts

Перед началом работы я воспользовался программой remediator для того, чтобы перевести файл.pdb в старый формат:

remediator --old '1gts.pdb' > '1gts_old.pdb'

Это нужно для того, чтобы программы пакета 3DNA корректно работали с моей тРНК, т. к. они поддерживают только старый формат .pdb.

После этого я воспользовался программами find_pair и analyze:

find_pair -t '1gts_old.pdb' stdout | analyze

Зачем мне это было нужно: программа find_pair определяет спаренные основания и положения спиралей в структуре, а с опцией -t она не будет пропускать модифицированные основания в цепях; программа analyze создаст множество файлов с разными описаниями структуры, т. е., кратко говоря, проанализирует все основания в структуре РНК, которую я ей подам на вход.

Так-с, все подготовительные работы выполнены, можно приступить к выполнению упражнений.

Упражнение 1

Определить значения торсионных углов в заданной структуре тРНК; определить, на какую из форм ДНК больше всего похожи тяжи этой структуры.

Для этого упражнения мне нужно проделать все те же самые подготовительные работы, что я описал выше, со структурами 3-х форм ДНК. Это нужно для сравнения моей структуры тРНК (точнее её торсионных углов) с торсионными углами 3-х форм ДНК. Для этого сравнения я решил использовать сгенерированные с помощью программы fiber структуры 3-х форм ДНК, посчитав, что они являются идеальными представителями своих структур среди всего остального множества структур ДНК.

Далее я представлю сравнения торсионных углов тРНК с разными формами ДНК:

Исходя из приведённых выше таблиц торсионных углов, методом "пристального взгляда" (да и смотря на 3D-структуру в JMol) можно примерно оценить, что больше всего моя структура тРНК похожа на А-форму ДНК.

Упражнение 2

Для этого упражнения нам понадобится таблица о водородных связях в тРНК из файла формата .out, который нам выдала программа analyze. Вот она:

            Strand I                    Strand II          Helix
   1   (0.015) ....>B:...2_:[..G]G-----C[..C]:..71_:B<.... (0.014)     |
   2   (0.012) ....>B:...3_:[..G]G-----C[..C]:..70_:B<.... (0.005)     |
   3   (0.017) ....>B:...4_:[..G]G-----C[..C]:..69_:B<.... (0.010)     |
   4   (0.012) ....>B:...5_:[..G]G-----C[..C]:..68_:B<.... (0.008)     |
   5   (0.020) ....>B:...6_:[..U]U-----A[..A]:..67_:B<.... (0.011)     |
   6   (0.011) ....>B:...7_:[..A]A-----U[..U]:..66_:B<.... (0.014)     |
   7   (0.017) ....>B:..49_:[..C]C-----G[..G]:..65_:B<.... (0.010)     |
   8   (0.021) ....>B:..50_:[..G]G-----C[..C]:..64_:B<.... (0.008)     |
   9   (0.009) ....>B:..51_:[..A]A-----U[..U]:..63_:B<.... (0.017)     |
  10   (0.012) ....>B:..52_:[..G]G-----C[..C]:..62_:B<.... (0.012)     |
  11   (0.010) ....>B:..53_:[..G]G-----C[..C]:..61_:B<.... (0.007)     |
  12   (0.009) ....>B:..54_:[..U]U-**--A[..A]:..58_:B<.... (0.011)     |
  13   (0.015) ....>B:..55_:[..U]U-**+-G[..G]:..18_:B<.... (0.014)     x
  14   (0.010) ....>B:..37_:[..A]A-**--U[..U]:..33_:B<.... (0.017)     |
  15   (0.018) ....>B:..38_:[..U]U-*---U[..U]:..32_:B<.... (0.019)     |
  16   (0.014) ....>B:..39_:[..U]U-----A[..A]:..31_:B<.... (0.011)     |
  17   (0.011) ....>B:..40_:[..C]C-----G[..G]:..30_:B<.... (0.008)     |
  18   (0.010) ....>B:..41_:[..C]C-----G[..G]:..29_:B<.... (0.012)     |
  19   (0.008) ....>B:..42_:[..G]G-----C[..C]:..28_:B<.... (0.009)     |
  20   (0.010) ....>B:..43_:[..G]G-----C[..C]:..27_:B<.... (0.008)     |
  21   (0.012) ....>B:..44_:[..C]C-**--A[..A]:..26_:B<.... (0.014)     |
  22   (0.014) ....>B:..10_:[..G]G-----C[..C]:..25_:B<.... (0.008)     |
  23   (0.009) ....>B:..11_:[..C]C-----G[..G]:..24_:B<.... (0.016)     |
  24   (0.010) ....>B:..12_:[..C]C-----G[..G]:..23_:B<.... (0.015)     |
  25   (0.010) ....>B:..13_:[..A]A-**+-A[..A]:..45_:B<.... (0.012)     |
  26   (0.013) ....>B:..14_:[..A]A-**--U[..U]:...8_:B<.... (0.030)     |
  27   (0.013) ....>B:..15_:[..G]G-**+-C[..C]:..48_:B<.... (0.011)     x
  28   (0.015) ....>B:..19_:[..G]G-----C[..C]:..56_:B<.... (0.009)     +

Пункт 1

Определить номера нуклеотидов, образующих стебли во вторичной структуре заданной тРНК.

Судя по данным о водородных связях в структуре, что нам предоставил analyze, в данной тРНК есть 4 стебля (стеблем будем считать хотя бы 2 пары нуклеотидов):

  1. 2...7 --- 71...66;
  2. 49...53 --- 65...61;
  3. 37...44 --- 33...26;
  4. 10...12 --- 25...23.

Пункт 2

Определить неканонические пары оснований в структуре тРНК.

Как видно из таблицы водородных связей, неканонических взаимодействий между основаниями всего 8:

  1. 54.U --- 58.A;
  2. 55.U --- 18.G;
  3. 37.A --- 33.U;
  4. 38.U --- 32.U;
  5. 44.C --- 26.A;
  6. 13.A --- 45.A;
  7. 14.A --- 8.U;
  8. 15.G --- 48.C.

Пункт 3

Определить, есть дополнительные водородные связи в тРНК, стабилизирующие ее третичную структуру.

В общем, нам следует рассмотреть комплементарные пары, не относящиеся к стеблям, чтобы найти нужные водородные связи. И, судя по таблице, такие есть:

  1. 54.U --- 58.A (неканоническая);
  2. 55.U --- 18.G (неканоническая);
  3. 13.A --- 45.A (неканоническая);
  4. 14.A --- 8.U (неканоническая);
  5. 15.G --- 48.C (неканоническая);
  6. 19.G --- 56.C.

Упражнение 3

Найти несколько возможных стекинг-взаимодействия в данной тРНК и построить их стандартные изображения, а также провести некий анализ.

Для этого я в том же файле с расширением .out нашёл таблицу с информацией о перекрывании друг друга 2-х пар азотистых оснований:

Overlap area in Angstrom^2 between polygons defined by atoms on successive
bases. Polygons projected in the mean plane of the designed base-pair step.

Values in parentheses measure the overlap of base ring atoms only. Those
outside parentheses include exocyclic atoms on the ring. Intra- and
inter-strand overlap is designated according to the following diagram:

                    i2  3'      5' j2
                       /|\      |
                        |       |
               Strand I |       | II
                        |       |
                        |       |
                        |      \|/
                    i1  5'      3' j1

     step      i1-i2        i1-j2        j1-i2        j1-j2        sum
   1 GG/CC  3.94( 2.63)  0.00( 0.00)  0.11( 0.00)  0.45( 0.00)  4.50( 2.63)
   2 GG/CC  3.47( 2.13)  0.00( 0.00)  0.32( 0.00)  0.06( 0.00)  3.85( 2.13)
   3 GG/CC  4.03( 2.40)  0.00( 0.00)  0.43( 0.00)  0.00( 0.00)  4.46( 2.40)
   4 GU/AC  6.72( 4.06)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  3.98( 2.46) 10.69( 6.52)
   5 UA/UA  0.57( 0.00)  0.00( 0.00)  0.99( 0.81)  0.27( 0.00)  1.83( 0.81)
   6 AC/GU  3.17( 1.94)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  6.23( 3.27)  9.40( 5.21)
   7 CG/CG  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  5.38( 2.44)  0.00( 0.00)  5.38( 2.44)
   8 GA/UC  4.81( 3.25)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  2.38( 0.36)  7.19( 3.62)
   9 AG/CU  2.80( 2.62)  0.00( 0.00)  0.43( 0.00)  0.16( 0.00)  3.38( 2.62)
  10 GG/CC  3.44( 1.90)  0.00( 0.00)  1.26( 0.00)  0.00( 0.00)  4.70( 1.90)
  11 GU/AC  6.64( 3.76)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  4.74( 1.88) 11.38( 5.63)
  12 UU/GA  4.64( 1.93)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  6.32( 3.38) 10.96( 5.31)
  13 UA/UG  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)
  14 AU/UU  4.44( 0.95)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  4.06( 2.00)  8.49( 2.95)
  15 UU/AU  1.18( 0.28)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  6.21( 3.83)  7.39( 4.11)
  16 UC/GA  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.02( 0.00)  2.71( 1.21)  2.73( 1.21)
  17 CC/GG  0.31( 0.00)  0.00( 0.00)  0.45( 0.00)  3.81( 2.49)  4.57( 2.49)
  18 CG/CG  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  5.89( 2.70)  0.00( 0.00)  5.89( 2.70)
  19 GG/CC  3.71( 2.31)  0.00( 0.00)  0.60( 0.00)  0.06( 0.00)  4.37( 2.31)
  20 GC/AC  6.71( 3.74)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  4.45( 2.11) 11.16( 5.85)
  21 CG/CA  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)
  22 GC/GC  4.62( 1.70)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  5.86( 2.85) 10.47( 4.54)
  23 CC/GG  0.06( 0.00)  0.00( 0.00)  0.34( 0.00)  2.63( 1.12)  3.03( 1.12)
  24 CA/AG  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)
  25 AA/UA  0.00( 0.00)  2.55( 0.10)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  2.55( 0.10)
  26 AG/CU  3.78( 1.42)  0.00( 0.00)  0.04( 0.00)  0.00( 0.00)  3.82( 1.42)
  27 GG/CC  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)  0.00( 0.00)

Из этой таблицы я взял 3 "шага" азотистых оснований (2 пары азотистых оснований, расположенных последовательно друг за другом) с максимальным значением sum (т. е. полной площади перекрывания): 11-ю (значение 11.38), 20-ю (значение 11.16), 12-ю (значение 10.96), и с минимальным значением: 5-ю (значение 1.83), 25-ю (значение 2.55) и 16-ю (значение 2.73), и построил изображения их перекрываний.

Построил я эти стандартные изображения с помощью некоторой последовательности команд:

Сначала я вырезал нужные мне "шаги" азотистых оснований из большого файла stacking.pdb, их содержащего, и поместил в файл stepXX.pdb, где 'XX' - номер "шага" (может быть однозначным):

ex_str -XX stacking.pdb stepXX.pdb

Далее я с помощью программы stack2img построил на основе файла stepXX.pdb изображения "наших" шагов:

stack2img -cdolt stepXX.pdb stepXX.ps

И с помощью программы ps2pdf перевёл .ps-изображения в формат .pdf:

ps2pdf stepXX.ps

Которые, позже перенеся на компьютер, я экспортировал в формат .jpg и вставил в этот сайт.

step11.jpg
Рис. 1. 11-й "шаг" азотистых оснований
step20.jpg
Рис. 2. 20-й "шаг" азотистых оснований
step12.jpg
Рис. 3. 12-й "шаг" азотистых оснований
step5.jpg
Рис. 4. 5-й "шаг" азотистых оснований
step25.jpg
Рис. 5. 25-й "шаг" азотистых оснований
step16.jpg
Рис. 6. 16-й "шаг" азотистых оснований

Как мы можем заметить, в "шагах" с меньшей площадью перекрывания вклад стекинг-взаимодействий будет непренебрежимо мал в сравнениями с остальными факторами, создающими вторичную структуру тРНК, так как либо угол поворота по оси, находящейся между основаниями в паре, очень велик (на рисунке 5 2 пары в "шаге" практически перпендикулярны друг другу), либо смещены друг относительно друга так, что ни о каких "стопках" не может идти и речи. В принципе расположение пар в "шагах" на рисунках 4-6 очень слабо напоминает стэкинг в его классическом понимании в супрамолекулярной химии.

В это же время на картинках 1-3, на которых, напомню, изображены "шаги" с наибольшей площадью перекрывания пар, ситуация обстоит, на мой взгляд, куда лучше: пары расположены практически ровно друг над другом, т. е. ароматические азотистые основания укладываются там в подобие "стопки", что обеспечивает допольнительную поддержку вторичной структуры.

Заключая, нужно проверить эти "шаги" в JMol, что будет показано на картинках ниже. Получал я их с помощью вот такого вот этого скрипта.

step11_jmol.jpng
Рис. 7. 11-й "шаг" азотистых оснований в JMol
step20_jmol.png
Рис. 8. 20-й "шаг" азотистых оснований в JMol
step12_jmol.png
Рис. 9. 12-й "шаг" азотистых оснований в JMol
step5_jmol.png
Рис. 10. 5-й "шаг" азотистых оснований в JMol
step25_jmol.png
Рис. 11. 25-й "шаг" азотистых оснований в JMol
step16_jmol.png
Рис. 12. 16-й "шаг" азотистых оснований в JMol

Как мы можем заметить, изображения из JMol почти полностью идентичны таковым из stack2img, что только подтверждает то, что программа analyze довольно качественно определила стекинг-взаимодействия в нашей структуре тРНК.