Занятие 4. Поиск гомологов некодирующей нуклеотидной последовательности

Таблица 1. Выбор тРНК

Аминокислотный остаток в 4-ой позиции белка KPYK1_ECOLI		Thr
Соответствующий кодон в гене pykF		5'-ACC-3'
Идеальный антикодон		5'-GGU-3'
Сколько можно было бы ожидать разных тРНК для остатка T (если опираться на генетический код)?		4
Сколько тРНК для остатка T аннотировано в геноме кишечной палочки?		4
Характеристика выбранной для дальнейшего изучения тРНК:
	название гена	thrV
	координаты гена в записи EMBL	3421602…3421677
	антикодон	GGU

Известно, что количество тРНК значительно меньше, чем количество смысловых кодонов. Это связано с тем, что тРНК одного типа может узнавать несколько кодонов в случае, если первые 2 нуклеотида кодона совпадают со вторым и третьим нуклеотидами антикодона. А третий нуклеотид кодона, являющийся вырожденным, не обязательно совпадет с третьим нуклеотидом антикодона. Такая неоднозначность компенсируется тем, что генетический код вырожден и одну аминокислоту чаще всего кодирует триплет с различающимся третьим нуклеотидом.

Команда, использованная для поиска всех треониновых тРНК в геноме:

grep “anticodon.*threonine” ecoli.embl > thr

Результат поиска тРНК:

6073:FT /note="codon recognized: ACG; anticodon: CGU threonine

77177:FT /note="codons recognized: ACY; anticodon: GGU threonine

93943:FT /note="codons recognized: ACD; anticodon: UGU threonine

93979:FT /note="codons recognized: ACY; anticodon: GGU threonine

Как видно, распозналось три типа кодонов вместо четырех: ACG, ACY, ACD вместо ACC, ACG, ACU, ACA.

Последовательность гена thrV извлекали из генома E.coli командой:

seqret ecoli.embl -sask

далее отвечали на запросы программы:

Begin at position [start]: 3421602

End at position [end]: 3421677

Reverse strand [N]: n

output sequence(s) [u00096.fasta]: thrV.fasta

Поиск гомологичных тРНК в геноме архебактерии

Таблица 2. Поиск в геноме Pyrococcus furiosus последовательностей, сходных с  треониновой тРНК E.coli

Программа		FastA	BLASTN	MegaBLAST	Discontigous MegaBLAST
Число находок с Е-value < 0,001		3	0	-	-
Характеристика лучшей находки:
	E-value находки	3.6е-05	5.9	-	-
	Номер сектора генома	52	164	-	-
	AC соответствующей записи EMBL	AE010257	AE010289	-	-
	координаты выравнивания(-ий) в записи EMBL	9586…9637	9981…9992	-	-
Аннотация лучшей находки по EMBL (не аннотирована, аннотирована как тоже треониновая тРНК, как другая тРНК etc.)		аннотирована как треониновая тРНК с антикодоном GGT	Формальдегид ферредоксин оксидоредуктаза WOR4	-	-

Выдача BLASTN такова, что мы не можем судить, найдены ли гомологи гена thrV в геноме E.coli или нет, так как e-value во всех находках очень высокое. Команда:

blastall -p blastn -d Pm -i thrV.fasta -o sq

Отсутствие каких-либо находок в выдаче MegaBLAST обусловлено длиной якоря 28 п.н. по умолчанию. Если посмотреть на выравнивание BLASTa, то можно видеть, что непрерывных участков длинее 28 там нет. Команда:

megablast -d Pm -i thrV.fasta -o mb

Поиск с помощью Discontigous MegaBLAST отличается тем, что можно задавать паттерн с параметрами -t - длина паттерна, -W - длина якоря и -N - взаимное расположение значащих и незначащих позиций (N=0 - паттерн для поиска последовательностей, кодирующих белки, что связано с вырожденостью, N=1 - позиции распределены случайно, N=2 - использование обоих паттернов). Поиск проводился с длиной якоря 11, который был специально подобран по длине непрерывных участков в выдаче BLASTN и с параметром N=2, чтобы повысить вероятность появления гомологов в выдаче Discontigous MegaBLAST . Но, несмотря на это, результат не дал ничего. Команда:

megablast -d Pm -i thrV.fasta -W 11 -t 16 -N 2 -o dmb

Видимо, MegaBLAST и Discontigous MegaBLAST не предназначены для поиска гомологов в столь отдаленных от E.coli организмах.

По результатам FastA выяснилось, что у гена thrV есть один достаточно близкий гомолог гена тРНК архебактерии Pyrococcus furiosus. При первом запуске программы остальные 2 находки, имеющие e-value оказались ниже порога 0.001, поэтому не будем считать гомологами из-за их cлишком высокого значения e-value. Также при многоразовом запуске FastA каждый раз наблюдалось изменение значения e-value находок. Особое внимание уделялось второй и третьей, так как каждый раз их e-value было то очень близко к первой находке, то очень далеко (изменение в диапазоне 2-3 порядков). Всвязи с этим вторую и третью находки гомологами считать не будем.

Таким образом, лучшей программой для поиска гомологов тРНК в отдаленных организмах оказалась FastA, а ближайшим гомологом гена thrV оказалась запись гена с АС AE010257 в секторе генома 52.