Электронная плотность. Рассеяние на электроне.

1. Выбор структуры белка для дальнейшей работы.

Я выбрала белок 4IP7 - печеночную пируваткиназу человека. Это довольно хорошо изученный и описанный белок, состоящий из 543 аминокислот.

Рисунок 1. Изображение тетрамера выбранного белка в двух различных ракурсах.

Данная структура удовлетворяет набору требований, необходимых для дальнейшей работы, а именно:

• Сервис EDS знает PDB-код, то есть для данной структуры в PDB доступна не только ее модель, но и экспериментальные данные.
• Для выбранного белка имеются подходящие структурные гомологи. Проверку осуществляем следующим образом: PDBeFold => launch => Query => вводим PDB код. Убеждаемся, что в таблице с находками не меньше 5 разных белков с RMSD от 0.8 до 2.5 ангстрем и N_align от 50 до 90% аминокислотных остатков входного белка. Всего было выявлено 289 гомологов. Информация о пяти выбранных подходящих гомологах представлена в таблице 1:

Таблица 1. Некоторые из найденных гомологов.

Название	RMSD	N_align	PDB ID
HUMAN PYRUVATE KINASE M2	0.83	504	1t5a
HUMAN M1 PYRUVATE KINASE	0.84	498	3srf
HUMAN ERYTHROCYTE PYRUVATE KINASE	0.97	500	2vgb
PYRUVATE KINASE FROM RABBIT MUSCLE WITH MG, K, AND L- PHOSPHOLACTATE	1.87	465	1afq
CRYSTAL STRUCTURE OF LEISHMANIA MEXICANA PYRUVATE KINASE (LMPYK) IN COMPLEX WITH FRUCTOSE 2,6 BISPHOSPHATE	2.19	467	3hqq

2. Получение необходимых файлов.

На сайте PDB были получены PDB модель выбранной структуры, файл mmCIP и файл структурных факторов. На сайте EDS в разделе Download => Maps была получена карта электронной плотности для выбранной структуры (использовались параметры по умолчанию).
Разрешение для полученной структуры 1.8 Å:

REMARK   2 RESOLUTION.    1.80 ANGSTROMS.

В .pdb-файле находится информация об атомах белка, каждому атому соотвествует строчка ATOM. В файле со структурными данными находится информация о всех структурных факторах, полученных в результате эксперимента. Ниже представлен фрагмент файла структурных факторов:

_refln.crystal_id
_refln.wavelength_id
_refln.scale_group_code
_refln.index_h
_refln.index_k
_refln.index_l
_refln.status
_refln.F_meas_au
_refln.F_meas_sigma_au
_refln.F_calc
_refln.phase_calc
_refln.fom
1 1 1  -43    0    1 o    100.8   10.2      116.5   180.0  1.00
...

Строчки _refln соответствуют столбцам данных, которые далее приведены в файле. Информация о каждом структурном факторе указана в отдельной строчке.
В .pdb-файле находится 17146 строчек, содержащих информацию об атомах белка. В файле структурных данных находится 221991 строчек, содержащих информацию об отдельных структурных факторах. Таким образом, количество структурных факторов не соответствует количеству атомов в белке. Собственно, в этом нет ничего удивительного, так как структурные факторы описывают весь кристалл белка, а не отдельные атомы. Но используя структурные данные можно получить модель молекулы, содержащую информацию об отдельных атомах.

3. Изображение электронной плотности структуры.

Для того, чтобы оценить качество модели выбранной структуры, на нее в программе PyMOL была наложена карта электронной плотности. На рисунке 2 изображены различные уровни подрезки электронной плотности (1σ, 2σ и 3σ) для всей полипептидной цепи. Для того, чтобы отсечь сигнал от соседних молекул, учитывалась только электронная плотность на расстоянии не больше 2.5 Å от молекулы.

Рисунок 2. Различные уровни подрезки электронной плотности для всей полипептидной цепи.

На рисунке видно, что уже при уровне подрезки 2σ для некоторых участков молекулы пропадает электронная плотность, а при 3σ целые домены практически полностью лишены электронной плотности. Эти участки соответствуют β-бочонкам, которые можно видеть на рисунке 1. Подробнее эта область с различными уровнями подрезки показана на рисунке 3.

Рисунок 3. Различные уровни подрезки электронной плотности для β-бочонка. При уровне подрезки 3σ электронная плотность практически полностью исчезает на данном участке.

Далее для оценки качества модели, были получены изображения электронной плотности с различным уровнем подрезки для отдельных аминокислот.

Рисунок 4. Электронная плотность с уровнем 1σ для 35-37 аминокислот Ala-Asp-Thr.	Рисунок 5. Электронная плотность с уровнем 2σ для 35-37 аминокислот Ala-Asp-Thr.	Рисунок 6. Электронная плотность с уровнем 3σ для 35-37 аминокислот Ala-Asp-Thr.
Рисунок 7. Электронная плотность с уровнем 1σ для 527-529 аминокислот Trp-Arg-Pro.	Рисунок 8. Электронная плотность с уровнем 2σ для 527-529 аминокислот Trp-Arg-Pro.	Рисунок 9. Электронная плотность с уровнем 3σ для 527-529 аминокислот Trp-Arg-Pro.

На рисунке 4 видно, что электронная плотность достаточно хорошо соответствует модели, а вот на рисунках 5 и 6 электронная плотность пропадает для бокового радикала аспарагиновой кислоты, несмотря на то, что там расположены два электроотрицательных атома кислорода.
На рисунке 7 видны шумы, которые практически исчезают на рисунке 8 при увеличении уровне подрезки электронной плотности. На рисунке 9 уже опять пропадают участки, соответсвующие боковым радикалам аминокислот.
Таким образом, можно точно сказать, что подрезка 3σ - слишком сильная. При уровне 1σ могут встречаться не очень сильные шумы, которые практически полностью исчезают при 2σ. Для данной структуры разрешение 1.8 Å, это очень хорошее разрешение, и похоже, что модель достаточно хорошо соответствует структуре.