Построение дерева по нуклеотидным последовательностям

Для работы были получены последовательности в формате fasta 16S РНК бактерий с мнемониками: BACAN,CLOB1,ENTFA,FINM2,GEOKA,LACAC,LISMO,STAA1. Особенности 16S РНК показаны в Таблице 1.

мнемоника вида	AC embl	координаты	цепь
BACAN	AE016879	9335:10841	+
CLOB1	CP000726	9282:10783	+
ENTFA	AE016830	248466:249987	+
FINM2	AP008971	197837:199361	+
GEOKA	BA000043	10421:11973	+
LACAC	CP000033	59255:60826	+
LISMO	AL591980	96266:97811	-
STAA1	AP009324	531922:533476	+

Полученные последовательности были выровнены программой t-coffee. На основе выравнивания в программе MEGA было построено филогенетическое дерево по алгоритму максимального правдоподобия, которое представлено на Рисунке 1.

Сравнение топологии полученного дерева с реальным:

Правильное дерево 
      /-CLOB1
   /-|
  |   \-FINM2
  |
--|      /-LACAC
  |   /-|
  |  |   \-ENTFA
   \-|
     |   /-STAA1
      \-|
        |   /-LISMO
         \-|
           |   /-GEOKA
            \-|
               \-BACAN
Полученное дерево 
               /-BACAN
            /-|
           |   \-STAA1
         /-|
        |  |   /-ENTFA
      /-|   \-|
     |  |      \-LISMO
   /-|  |
  |  |   \-GEOKA
  |  |
--|   \-LACAC
  |
  |   /-CLOB1
   \-|
      \-FINM2
Нетривиальные ветви Правильного дерева
{'BACAN', 'GEOKA'}vs{'FINM2', 'LACAC', 'ENTFA', 'STAA1', 'CLOB1', 'LISMO'}
{'CLOB1', 'FINM2'}vs{'BACAN', 'GEOKA', 'LACAC', 'ENTFA', 'STAA1', 'LISMO'}
{'BACAN', 'ENTFA', 'GEOKA', 'LACAC', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'CLOB1', 'FINM2'}
{'BACAN', 'GEOKA', 'LISMO'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'ENTFA', 'STAA1', 'FINM2'}
{'ENTFA', 'LACAC'}vs{'BACAN', 'GEOKA', 'FINM2', 'STAA1', 'CLOB1', 'LISMO'}
{'BACAN', 'GEOKA', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'ENTFA', 'FINM2'}
Нетривиальные ветви Полученного дерева
{'BACAN', 'ENTFA', 'GEOKA', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'FINM2'}
{'BACAN', 'ENTFA', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'GEOKA', 'FINM2'}
{'ENTFA', 'LISMO'}vs{'BACAN', 'GEOKA', 'FINM2', 'LACAC', 'STAA1', 'CLOB1'}
{'CLOB1', 'FINM2'}vs{'BACAN', 'GEOKA', 'LACAC', 'ENTFA', 'STAA1', 'LISMO'}
{'BACAN', 'ENTFA', 'GEOKA', 'LACAC', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'CLOB1', 'FINM2'}
{'BACAN', 'STAA1'}vs{'GEOKA', 'FINM2', 'LACAC', 'ENTFA', 'CLOB1', 'LISMO'}
Ветви которые есть в Правильном дереве, но отсутствуют в Полученном
{'ENTFA', 'LACAC'}vs{'BACAN', 'GEOKA', 'FINM2', 'STAA1', 'CLOB1', 'LISMO'}
{'BACAN', 'GEOKA'}vs{'FINM2', 'LACAC', 'ENTFA', 'STAA1', 'CLOB1', 'LISMO'}
{'BACAN', 'GEOKA', 'LISMO'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'ENTFA', 'STAA1', 'FINM2'}
{'BACAN', 'GEOKA', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'ENTFA', 'FINM2'}
Ветви которые есть в Полученном дереве, но отсутствуют в Правильном
{'BACAN', 'ENTFA', 'GEOKA', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'FINM2'}
{'ENTFA', 'LISMO'}vs{'BACAN', 'GEOKA', 'FINM2', 'LACAC', 'STAA1', 'CLOB1'}
{'BACAN', 'STAA1'}vs{'GEOKA', 'FINM2', 'LACAC', 'ENTFA', 'CLOB1', 'LISMO'}
{'BACAN', 'ENTFA', 'LISMO', 'STAA1'}vs{'LACAC', 'CLOB1', 'GEOKA', 'FINM2'}

Построение и анализ дерева, содержащего паралоги

Для поиска паралогов и гомологов белка CLPX_BACSU была использована программа blastp с e-value 1e-5 . Поиск проводился среди протеомов рассматриваемых бактерий. После чего найденные белки были извлечены из базы данных для анализа, после чего при помощи регулярных выражений имена были приведены в надлежащий вид. Полный код процесса представлен ниже.

Получение гомологичных\ортологичных последовательностей

~/blast/ncbi-blast/bin/makeblastdb -in proteo.fasta -dbtype prot -parse_seqids
~/blast/ncbi-blast/bin/blastp -task blastp -query ./CLPX_BACSU.fasta -db proteo.fasta -evalue 1e-5 -outfmt "6 sseqid" -out blastp.txt
~/blast/ncbi-blast/bin/blastdbcmd -db proteo.fasta -entry_batch blastp.txt -outfmt "%f" -out proteins_for_tree.fasta

Полученные белковые последовательности в fasta формате были очищены от белков не рассматриваемых бактерий следующим скриптом:

clean.py

В результате получен фаста файл с результатами blastp относящимися только к белкам из бактерий с мнемоникакми 'BACAN', 'GEOKA', 'LISMO', 'STAA1','LACAC', 'CLOB1', 'ENTFA', 'FINM2'.

Далее эти белки белки были выровнены программой t-coffee, получен фаста файл с выровненными последовательностями.

По полученному выравниванию при помощи программы MEGA было построено дерево гомологов белка CLPX_BACSU по алгоритму объединения соседей с поддержкой бутстрепом (500 реплик) на основе множественного выравнивания гомологичных последовательностей программой t-coffee. Консенсусное дерево представлено на Рисунке 2. На нем же подписаны ортологи и паралоги; зеленый квадрат-дупликация гена, желтый круг-видообразование.

.