История запросов

Запрос Запрос как его понял PubMed из Search details Всего находок Всего в открытом доступе Всего обзоров
Kip1 Kip1[All Fields] 3039 1636 116
Kip1[Title/Abstract] Kip1[Title/Abstract] AND ("2008/03/14"[PDat] : "2013/03/12"[PDat]) 1091 546 36
Kip1[Title] Kip1[Title] 669 304 19
Kip1[Title] Kip1[Title] AND (Review[ptyp] AND "2008/03/14"[PDat] : "2013/03/12"[PDat]) 7 3 7
  Related citation for "Multiple mechanisms for p27(Kip1) translocation and degradation." 123 61 23

Персональная коллекция

Ссылка на собственную публичную коллекцию статей по белку Kip1 (p27):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/myncbi/collections/public/1XUlkeW2tjebf1huRdrHof658/

A growth factor-dependent nuclear kinase phosphorylates p27Kip1 and regulates cell cycle progression

Зависимая от фактора роста ядерная фосфотрансфераза фосфорилирует белок p27Kip1 и регулирует клеточный цикл

Introduction

Опираясь на другие работы, в этой части статьи авторы проводят небольшой обзор о том, что такое Kip1:
"Белок p27 является важным регулятором для клеточного цикла млекопитающих. Увеличение количества белка p27 приводит делящиеся клетки к выходу из клеточного цикла, в то время как уменьшение - требуется для возобновления деления покоящихся клеток. Низкое содержание белка p27 связано с чрезмерным делением клеток в таких патологических состояниях, как воспаление и опухоли. Высокий уровень белка p27 наблюдается в условиях уменьшенной клеточной пролиферации, в таких как поздние стадии заживления артериальных ран при атеросклерозе.

p27 регулируется транскрипционными, трансляционными и протеолитическими механизмами. Главным механизмом в регуляции p27 является протеолиз с помощью убиквитин-протеасом. Фосфорилирование треонина 187 в p27 с помощью Cdk2 создаёт сайт связывания для Skp2-содержащей Е3 убиквитин-протеин лигазы, SCF, и убиквитилирование p27 с помощью SCF ведёт к деградации p27 на протеососме. Этот путь осуществляется в S и G2 фазах клеточного цикла после активирования Cdk2 циклином E и A. Второй протеолитический путь для контролирования p27 активируется митогенами и p27 деградирует в течение G0/G1. Инактивация p27 также происходит путём образования циклин D-Cdk комплексов.

Ещё одним сайтом фосфорилирования на p27 является серин 10 (S10). Фосфорилирование S10 сигнализирует о ядерном экспорте p27в цитоплазму, и принято считать, что фосфорилирование S10 участвует в деградации p27. Вопреки этим наблюдениям, механизмы регуляции фосфорилирования S10 плохо изучены. В частности белок, который фосфорилирует p27 по S10 и его роль в регуляции клеточного цикла не определены."

Далее авторы статьи говорят, что они определили серин-треонин киназу hKIS (human kinase interacting stathmin) как главную в фосфорилировании p27 по S10. Они продемонстрировали, что фосфорилирование p27 по S10 с помощью hKIS активируется митогенами в 0/G1 клетках и что эта модификация S10 облегчает ядерный транспорт p27 в цитоплазму. В добавок, они показали, что физиологическое значение фосфорилирования p27 по S10 с помощью hKISзаключается в её участии регулирования клеточного цикла.

Results

Идентификация серин/треонин киназы hKIS, которая взаимодействует с С-концом p27

Авторы предположили, что С-конец белка p27 будет важен для белок-белкового взаимодействия. Поэтому они провели дрожжевой двугибридный анализ, используя библиотеку человеческих B-клеток. Этот анализ выявил несколько кДНК, имеющих отношение к С-концу p27 так же отчётливо, как и к целому белку, но не к N-концу p27, p57 или p21 . Авторы установили, что клон KIS(C21), кодирующий 49 кДа белок, является человеческим гомологом KIS крысы (со схожестью в 98%). Авторами отмечено, что связывание hKIS с С-концом p27 является специфичным, в связи с результами двугибридного анализа.

Человеская KIS была картирована авторами на хромосоме 1q23.1 с помощью излучения. Нозерн-блот человеческой ткани выявил простую полосу в 9.4 килобаз во всех тканях, используя кДНК целого hKIS в качестве пробы. Наивысшие уровни экспрессии мРНК hKIS наблюдались в скелетных мышцах, почках, плаценте и лейкоцитах крови.

Взаимодействие hKIS с p27Kip1

Чтобы выяснить, связывается ли hKIS с p27 (и другими ингибиторами CDK) напрямую, авторы использовали белок-лиганд глютатион-S-трансферазу (GST) и искусственно синтезированный маркированный hKIS. Полученный сигнал подтверждал это.

Фосфорилирование p27 по S10 с помощью hKIS

Чтобы установить сайт фосфорилирования hKIS на p27, авторы создали дополнительные GST-белки. Было обнаружено, что пока hKIS сидит на С-конце p27, фосфорилирование проходит на N-конце. До этого момента S178и T187 были исключены из возможных сайтов фосфорилирования hKIS. Чтобы определить, является ли S10 мнимым сайтом, были проведены мутации N-конца: замена S10 на аланин прекращала фосфорилирование GST-p27. Это свидетельствует о том, что hKIS фосфорилирует p27 по S10.

Далее авторы предположили, что мутация S10A может менять структуру p27, что и уменьшает фосфорилирование p27 S10A-мутанта. Эта проблема была решена с помощью созданного на фосфопептид p27S10-p антитела, которое было использовано для вестерн блоттинга и тестов на поглощение.

Фосфорилирование hKIS p27 in vivo

Аторы также захотели убедиться, что hKIS фосфорилирует p27 и in vivo. Для этого были использованы иммунопреципитированный белок p27, инактивированный мутант hKIS K54A с меткой и вестерн-блот.

Экспрессия эндогенного hKIS

Чтобы исследовать экспрессию hKIS были получены поликланальные антитела из кролика и монокланальные - из мыши. Затем была проверена их специфичность с помощью вестерн-блоттинга на NIH 3T3 клетках и клетках гладкой мускулатуры.

Затем авторы установили локализацию hKS в клетках с помощью иммунофлюоресценции и конфокальной микроскопии. В NIH 3T3 клетках белок главным образом был обнаружен в ядре во время голодания и в цитоплазме - во время стимуляции. Интересно, что hKIS и p27 солокализуются в ядре (см. рис 1С).


Рис.1 Клеточная локализация hKIS
Более того, полученные авторами данные говорят о том, что экспрессия hKIS in vivo регулируется факторами, такими как сыворотка роста.

Взаимодействие эндогенного hKIS с p27 in vivo

Чтобы исследовать взаимодействие между hKIS и p27, авторы изучили фибробласты кожи дикой и нулевой (p27-/-) мыши. Отсутствие p27в нулевых клетках подтверждено вестерн-блотом. В итоге, hKIS соиммунопреципитируется с p27 в обычных клетках, но не в нулевых. Это и другое демонстрирует взаимодействие эндогенным hKIS с эндогенным p27 in vivo.

Фосфорилирование hKIS p27 по S10 in vivo зависимо от факторов роста

Авторами было установлено, что в голодающих G0 клетках NIH 3T3 активность hKIS снижена, и она увеличивается при стимуляции. Кроме того, с помощью радиоактивной метки это ещё раз доказано и снова показано, что фосфорилирование происходит по S10.

Фосфорилирование по S10 стабилизирует p27 в G1

Аторы выдерживали образцы в течение 0-8 ч и проводили иммунопреципитацию p27 для анализа. Основываясь на полураспаде p27, было установлено, что экспрессия hKIS в клетках стабилизирует p27 по сравнениею с её отсутствием.

Фосфорилирование hKIS S10 вызывает экспорт из ядра p27

В покоящихся клетках, экспрессирующих hKIS, p27 локализован как в ядре, так и в цитоплазме. Стимуляция клеток вызывает зависимое от времени перераспределение p27 в цитоплазму с окрашиванием ~80% клетки (благодаря имуннофлуоресценции). Введение в клетки ингибитора ядерного экспорта, лептомицина B, предотвращает распределение по цитоплазме p27 после 8 ч.

hKIS способствует клеточному циклу

Авторы создали несколько культур клеток, экспрессирующие разные белки. Так, клетки, содержащие p27, как и ожидалось показывают остановку клеточного цикла на G1, в то время как hKIS отменяет это ингибирование. Избыточная экспрессия hKIS или hKIS (K54A) сами по себе не изменяют протекание клеточного цикла. Экспрессия p27 вместе с hKIS (K54A) также не возобновляет клеточный цикл после G1, указывая на то, что функциональный эффект hKIS зависит от активности его киназы. S10A-мутант был более эффективен, чем p27, в остановке клеточного цикла, и его активность не отменялась экспрессией hKIS. S10D-мутант блокировал клеточный цикл менее эффективно, чем обычный p27. Экспрессия hKIS вместе с p21 не имела никакого эффекта в остановке клеточного цикла, подтверждая специфичность взаимодействия между hKIS и p27.

Materials and methods