RanHummer personal web-site

Поиск полиморфизмов у человека

Часть 1. Подготовка чтений

Очистка чтений с помощью Trimmomatic

Рис. 1 Качество чтений из выдачи fastqc до очистки

Рис. 2 Качество чтений из выдачи fastqc после очистки

fastqc chr12.fastq ## анализ качества чтений
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 chr12.fastq chr12t.fastq TRAILING:20 MINLEN:50 ## удаление некачественных чтений

• До очистки: 7157
• После очистки: 7023

Часть 2. Картирование

bwa index chr12.fasta ## Индексация референсной последовательности
bwa mem chr12.fasta chr12t.fastq > chr12_exom.sam ## Картирование чтения на референсную последовательность
samtools view -bo chr12_exom.bam chr12_exom.sam ## Переводит данные о картированных чтениях в бинарник
samtools sort chr12_exom.bam chr12_exom.sorted ## Сортировка чтений по координате начала чтения в референсе
samtools index chr12_exom.sorted.bam ## Индексирование сортированных чтений
samtools idxstats chr12_exom.sorted.bam ## Сколько чтений откартировались
chr12   133851895       7024    0 ## Выход программы samtools idxstats. 1-ая колонка - имя референсной последовательности,
 2-ая - её длина, 3-я - сколько чтений было откартировано, 4-ая - сколько чтений не было откартировано

Часть 3. Поиск SNP и инделей

samtools mpileup -uf chr12.fasta chr12_exom.sorted.bam > chr12_exom_SNPs.bcf ## создан файл с информацией об SNP
bcftools call -cv chr12_exom_SNPs.bcf -o chr12_exom_SNPs.vcf ## формат bcf > формат vcf; отличие между референсом и чтениями

• Всего инделей: 3
• Всего SNP: 35

У большинства замен покрытие 1-2 чтения, однако есть замены с очень хорошим покрытием (максимальное - 133 чтения). Качество варьируется примерно от 6 до 220

Часть 4. Аннотация SNP

perl /nfs/srv/databases/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4 chr12_exom_SNPs.vcf > chr12_exom_SNPs.avinput ## формат vcf > формат avinput
perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl --geneanno -out refGene -build hg19 -dbtype refGene chr12_exom_SNPs.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/ ## аннотация по б.д. refGene
perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl --filter -out dbsnp -dbtype snp138 -build hg19 chr12_exom_SNPs.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/ ## аннотация по б.д. dbsnp 
perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl --filter -out 1000genomes -dbtype 1000g2014oct_all -build hg19 chr12_exom_SNPs.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/ ## аннотация по б.д. 1000genomes
perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl --filter -out gwas -dbtype gwasCatalog -build hg19 chr12_exom_SNPs.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/ ## аннотация по б.д. GWAS
perl /nfs/srv/databases/annovar/annotate_variation.pl --filter -out clinvar -dbtype clinvar_20150629 -build hg19 chr12_exom_SNPs.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb/ ## аннотация по б.д. Clinvar

• RefGene делит замены на: exonic, intronic, UTR3, ncRNA_exonic.
  Из получившихся SNP:
  • 9 UTR3
  • 3 exonic
  • 26 intronic
  • 1 ncRNA_intronic
• SNP попали в гены CLEC2D, RPSAP52, HMGA2 и TMEM263
• SNP привели к одной синонимичной замене и двум несинонимичным
• dbsnp: 28 SNP имеют идентификатор rs (б.д. RefSeq)
• 1000genomes: большинство замен распространённые (от 18% до 70%). Также есть несколько редких замен (несколько процентов) и одна очень редкая замена около 0.9%, но с плохим качеством и покрытием.
• Ни в базе данных GWAS, ни в базе данных Clinvar не была обнаружена ни одна из замен.