EMBOSS: пакет программ для анализа последовательностей

1. С помощью команды seqret необходимо было несколько файлов в формате fasta собрать в единый файл. Для этого был создан список mylist.txt, содержащий адреса исходных последовательностей в формате usa. Далее с помощью команды:

 seqret @mylist.txt mysequences.fasta

был получен файл mysequences.fasta, который содержит уже сами последовательности.

2. С помощью команды seqretsplit нужно было один файл в формате fasta с несколькими последовательностями разделить на отдельные fasta файлы. В качестве исходного файла использовался файл mysequences.fasta, полученный в прошлом пункте. С помощью команды:

 seqretsplit mysequences.fasta -auto

были получены отдельные файлы с последовательностями: 1a1l1_takru.fasta, 1a34_human.fasta, 060l_iiv6.fasta, 081r_frg3g.fasta и 1433b_xentr.fasta.

3. С помощью команды seqret необходимо было из файла с хромосомой в формате .gb три кодирующих последовательности по указанным координатам "от", "до", "ориентация" и сохранить в одном fasta файле. Использовался файл sequence.gb, содержащий хромосому I Encephalitozoon romaleae. Далее был создан список list.txt, в котором содержит координаты кодирующих последовательностей. С помощью команды:

 seqret @list.txt seqs.fasta

были вырезаны соответствующие кодирующие последовательности по указанным координатам, каждая записана в файл: seqs.fasta.

4. С помощью команды transeq нужно было транслировать кодирующие последовательности, лежащие в одном fasta-файле, в аминокислотные, используя указанную таблицу генетического кода, при этом результат — в одном fasta-файле. На вход команде подавался файл seqs.fasta, полученный в предыдущем пункте:

 transeq seqs.fasta tran_seqs.fasta

Таким образом был получен файл tran_seqs.fasta, содержащий трансляции исходных последовательностей.

5. С помощью той же команды нужно было транслировать данную нуклеотидную последовательность в шести рамках. На вход команде подавалась последовательность gene.fasta:

 transeq gene.fasta tran_gene.fasta -frame 6

В итоге был получен файл tran_gene.fasta, содержащий шесть трансляций данной нуклеотидной последовательности.

Ссылка на остальные задания (для подготовки к коллоквиуму): tasks.html.

Построение карты локального сходства двух геномов

В этом задании необходимо было построить карту локального сходства двух бактерий и описать крупные эволюционные события на пути от общего предка.

Рис. 1. Электронная фотография Desulfurococcus kamchatkensis 1221n1

Для выполнения задания были выбраны две археи из одного рода: Desulfurococcus kamchatkensis 1221n и Desulfurococcus fermentans DSM 16532.
Систематика:

>Archea
>Crenarchaeota
>Thermoprotei
>Desulfurococcales
>Desulfurococcaceae
>Desulfurococcus

Геномы:
1)Desulfurococcus fermentans DSM 16532, размер генома: 1384116 п.н.
2)Desulfurococcus kamchatkensis 1221n, размер генома: 1365223 п.н.

Desulfurococcus — род термофильных анаэробных архей, найденных в зонах с высокой температурой среды, таких как глубоководные гидротермальные и подземные горячие источники. Оптимальная температура роста — 85ºC. Клетки сферические, окружены необычной белковой оболочкой, напоминающей решетку. Есть один длинный жгутик².

Для построения карты локального сходства использовался blast2seq ( алгоритм blastn) на сайте NCBI.
Характеристики полученного выравнивания (alignment.txt):

e-value = 0.0

identity = 97%

query cover = 91%

total score = 2.069e+06

На рис. 2 представлена полученная карта. По оси абсцисс в ней располагается геном Desulfurococcus kamchatkensis (для удобства будем обозначать как "геном А"), а по оси ординат — геном Desulfurococcus fermentans (как "геном В").

Рис. 2. Карта локального сходства исследуемых последовательностей.

Среди всех событий было выбрано четыре примера; синтеничные участки обозначены буквами с одинаковыми цифрами. Разберем эти примеры по пунктам:

1. Участок А1 в геноме В распологается дальше, чем в геноме А, т.е. имеет смысл говорить о транслокации участка в одном из геномов.
2. Видно, что участок В2 — это перевернутый на 180°, т.е. в одном из геномов произошла инверсия этого участка.
3. Участок А3 отсутствует в геноме В (на графике спроецирован в "точку" В3; понятно, что это условное обозначение). Это либо результат вставки в геноме А, либо делеции в геноме В.
4. И, наконец, участки А4 и В4. Учитывая тот факт, что у рассматриваемых архей ДНК кольцевые, можно предположить, что это вовсе не результат делеции/вставки, а просто по-разному установленные координаты начала последовательностей.

Все остальные случаи можно объяснить, как один из приведенных примеров.
Таким образом, гомологичные участки занимают большую часть геномов.

Построение нуклеотидного пангенома для 3 геномов близкородственных бактерий.

Для выполнения задания было выбрано 3 штамма бактерии Streptococcus pneumoniae (AP200, ATCC 700669, CGSP14).

Рис. 3. S. pneumoniae3

Систематика:

>Bacteria
>Firmicutes
>Bacilli
>Lactobacillales
>Streptococcaceae
>Streptococcus
>S. pneumoniae

Пневмококк — грамположительная шаровидная бактерия, факультативный анаэроб. Пневмококки являются одним из основных возбудителей менингита, среднего отита, синусита, внебольничной пневмонии у детей и взрослых. В последние годы проблема резистентности пневмококков к антимикробным препаратам обсуждается во многих странах⁴.

Далее идет общая информация о программе и пангеномах, приведенная здесь для того, чтобы мне было куда обратиться в будущем. Если вам это не нужно, переходите к п.1.

Пангеном может быть построен на основе ортологичных генов или ортологичных участков генома (нуклеотидный пангеном). Для построения пангенома NPGE использует данные о гомологичных участках, а не генах. Один блок может включать ортологи и паралоги.

Обозначения блоков:

• s – такие участки присутствуют по одному у всех изучаемых геномов (так называемые стабильные/коровые блоки);
• h – такие участки есть в части геномов (т.н. "полустабильные блоки");
• u – уникальные участки, которые встречаются только в одном геноме;
• r – блоки с повторами хотя бы в одном геноме;
• m – минорные участки, длиной меньше 100 н.п., разделяющие остальные блоки;
• g – глобальные блоки, состоящие из последовательно идущих во всех геномах s-блоков, перемежающихся блоками других типов (r-, h-, u- и m-).
  
  1. Процесс построения с помощью пакета NPG-explorer.
  
  В директории девятого практикума была создана директория npge/, содержащая все файлы для работы с программой, а также полученные в результате работы практикума файлы. Сначала был создан входной файл genomes.tsv с информацией о последовательностях геномных ДНК. Затем с помощью команды (1) был создан файл npge.conf с несколькими параметрами. С помощью команды (2) был получен файл identity_recommended.txt, в котором записана вычисленная доля консервативных позиций в малом числе блоков (0,986), а также рекомендованное (на 1 меньше) значение параметра MIN_IDENTITY (0,886), которое и было записано в упомянутый файл с параметрами.

   (1) npge -g npge.conf
   (2) npge Prepare
   (3) npge Examine

  После всего этого с помощью команды (4) был получен нуклеотидный пангеном (протокол выполнения был направлен в файл log). Затем командой (5) было получено много файлов с аналитической информацией о построенном пангеноме.

   (4) npge MakePangenome > log
   (5) npge PostProcessing

  Так был получен файл pangenome.info, содержащий данные о всех блоках.
  
  2. Описание синтеничных участков (g-blocks).
  
  Для анализа синтеничных участков таблица из файла blocks.blocks была открыта в Excel, транспонирована и раскрашена в соответствии с блоками. На рис.3 представлена полученная таблица. Строки, вообще не содержащие g-блоков, удалены. Выравнивание в qnpge не приведено, т.к. оно не отличается, а делать его изображение довольно занудно.
  
  
  
  
  На таблице видно, что из всех блоков только 13 g-блоков (не выделены) локализуются в геноме одинаково. Однако среди них есть блоки, для которых ориентация в разных геномах не одинаковая (например, для блока g3x765), т.е. возможна инверсия в одном из геномов. В столбце "conservative" в подобных строках стоит прочерк. Остальные блоки этой группы можно вполне назвать консервативными.
  Одинаковыми цветами выделены одинаковые блоки, располагающиеся в разных местах в геномах. Я не заметила какого-то определенного закона, по которому блоки в разных геномах смещены друг относительно друга. Но у геномов AP200 и ATCC есть несколько блоков, располагающихся во взаимнопротивоположном направлении. Например, у AP200 блоки идут в таком порядке: g3x493 >, g3x107 <, g3x101872 >, g3x50750 <; а для ATCC эти блоки расположены в обратном порядке да еще и направлены в обратную сторону, т.е.: g3x50750 >, g3x101872 <, g3x107 >, g3x493 <. Так, можно предположить, что произошла инверсия целых четырех блоков (в одном из геномов). Похожая ситуация у тех же двух геномов с тремя блоками g3x981, g3x586, g3x17817, но в этом случае противоположно направлен только второй блок.
  Общее число g-блоков: 24.
  Помимо этого, в некоторых местах стоят i-блоки, о которых мне, к сожалению, ничего пока неизвестно.
  Таким образом, выравнивание подтверждает быструю эволюцию у бактерий (даже внутри вида).
  
  3. Описание ядра пангенома (s-блоков).
  
  В файле pangenome.info секция 'Exact stem blocks'.
  • Общее число блоков: 415
  • Размер ядра: 71.34%
  • Сходство геномов: 98,5%
  
  
  4. Филогенетическое дерево геномов

  Рис. 6. Филогенетическое дерево геномов.

  
  
  С помощью ITOL (itol.embl.de/) было визуализировано филогенетическое дерево геномов, построенное по объединенному выравниванию s-блоков (файл nj-global-tree.tre). Полученное изображение представлено на рис. 6.
  
  Таким образом, можно предположить, что геномы штаммов ATCC и CGSP14 имеют меньше отличий друг от друга, чем от генома штамма AP200. Это видно по длине ветвей. Обычно эти длины — это отношение числа всех замен нуклеотидов в последовательности генома к длине этой самой последовательности⁵. Длины ветвей отражают число неидентичных позиций в выравнивании двух последовательностей. Npge вычисляет также число диагностических позиций (т.е. в данном случае позиций, в которых в двух геномах одна буква, а в третьем — другая). Кажется, именно это число здесь показывает ITOL.
  
  
  
  
  
  5. Описание одного из r-блоков
  
  На рис. 4 представлен блок r15x101 в визуализаторе qnpge.
  Некоторые характеристики блока:
  • число найденных фрагментов: 15
  • число колонок в выравнивании: 101
  • сходство: 91.08%

  Рис. 5. Аннотация исследуемого участка.

  
  
  Таким образом, в каждом геноме было найдено несколько фрагментов: для AP200 — 3, ATCC — 7, CGSP14 — 5. qnpge определил этот участок как ген, кодирующий транспозазу. Я решила проверить и выполнила поиск blastn.
  Все находки принадлежали тому же роду, что и наши бактерии. Затем я выбрала одну из находок и посмотрела, что это за участок (для находки он имеет координаты 9786-9881). Оказалось, что он является мобильным элементом (точнее, его частью). На рис. 5 показана его аннотация (Z82001.1).
  Оказалось, что это инсерционная последовательность — короткий фрагмент ДНК с двумя важными характеристиками: маленькое сходство с другими мобильными элементами и кодирование белков, вовлеченных в процесс транспозиции (в основном транспозаза)⁶.
  В общем, qnpge был прав.
  
  
  6. Пример делеции (в геномах, не вошедших в h-блок)
  
  
  
  
  
  Рассмотрим блок h2x1473 (см. рис. 6).
  Некоторые характеристики блока:
  • число найденных фрагментов: 2
  • число колонок в выравнивании: 1473
  • сходство: 100%
  • число генов: 18
  npge нашел этот участок только у двух штаммов: AP200 и ATCC 700669. Также программа определила старт-кодон ТТА (п. 62-64) и стоп-кодон САА (п.857-859). Однако ген на этом участке был определен неоднозначно: для генома штамма AP200 программа указала ген "Restriction endonuclease S subunit", в то время как для генома штамма ATCC участок содержит перекрывающиеся гены.
  
  

  Рис. 7. Аннотация гена в записи GenBank

  Для проверки была открыта запись GenBank генома AP200 (рис. 7).
  
  На приведенном скрине видно, что определенный npge ген в за
  писи GenBank аннотирован как ген, кодирующий интегразу (позиции выделены желтым). И как раз после него определен ген эндонуклеазы рестрикции (позиции выделены зеленым), который npge нашел на предыдущем участке. Для записи генома ATCC этот участок никак не аннотирован (и вообще для этого штамма очень мало аннотированных генов), поэтому сложно было сопоставить результаты только по двум этим геномам. Для того, чтобы убедиться в правильной аннотации гена, по последовательности участка был выполнен поиск megablast (ограничение по исследуемому роду), в результате чего было найдено довольно много гомологичных последовательностей. Для проверки я выбрала геном штамма JJA. В записи GenBank найденный участок (п. 456969-457766) аннотирован как "integrase/recombinase, phage integrase family". Таким образом, можно заключить, что npge немного ошибся с определением гена.
  
  Далее я попыталась найти сходную последовательность в геноме CGSP14 самостоятельно с помощью blast2seq. В итоге гомологичных участков найдено не было. Делаем вывод, что в геноме штамма CGSP14 произошла делеция данного участка.
  
  В то же время я бы не была так уверена насчет делеции этого участка, т.к. это ген, кодирующий интегразу вируса. Возможно, в других штаммах как раз произошла вставка этого гена по сравнению с геномом "общего предка", в то время как в геноме штамма CGSP14 этого эволюционного события не было [вообще, здесь не помешал бы комментарий от проверяющего преподавателя].
  
  
  
  
  7. Пример последовательности, имеющейся только в одном геноме.
  
  В качестве примера был выбран блок u1x2511 (рис. 8).
  
  
  
  
  
  Данная последовательность была найдена только в геноме штамма CGSP14. npge определил две рамки считывания: 1-й старт-кодон ТТА (п. 109-111), 1-й стоп-кодон САТ (п. 1423-1425) и соответственно ген "ABC transporter, ATP-binding protein"; и 2-й старт-кодон ТТА (п. 1443-1445) и 2-й стоп-кодон САА (п. 2241-2243) и ген, кодирующий какой-то гипотетический белок ("hypothetical protein"). В записи GenBank аннотирована только часть генов, и обсуждаемые участки в них не входят. Поэтому для них был выполнен поиск megablast. В записи GenBank штамма INV200 первый ген (п. 1333141-1334457) аннотирован также. Второй ген в том же геноме (1334475-1335275), как ни странно, аннотирован тоже как "ABC transporter". Вообще, blast выдал около 20 находок (все из того же рода), так что эти гены явно менее распространены в роду, чем, к примеру, ген интегразы, который обсуждался в предыдущем пункте (там находок было намного больше).
  ABC-транспортеры — суперсемейство транспортных белков, переносящих самые различные соединения. Белкам этого семейства свойственно наличие AТР-связывающего домена, имеющего характерную структуру. Хотя некоторые белки семейства ABC могут и не обладать транспортными функциями, подавляющее их большинство переносит разнообразные вещества (от неорганических ионов до полисахаридов, аминокислот и белков)⁷. АВС-транспортеры обеспечивают защиту бактерий от действия многих антибиотиков⁸.
  
  8. Пример расхождений аннотаций генов
  
  
  
  
  В качестве примера был выбран блок m12x96 (рис. 9). Рассмотрим найденные фрагменты в геноме штамма CGSP14. Для него всего было найдено 6 фрагментов, в каждом из которых программа обнаружила ген. Однако все аннотации отличаются друг от друга:
  • для участка CGSP14&chr&c_1964377_1964282 ген аннотирован как "glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase" (ГАФД);
  • для участка CGSP14&chr&c_1840797_1840702, который отличается от предыдущего только G вместо A в позиции 81 блока, ген аннотирован как "degenerate transposase";
  • для участка CGSP14&chr&c_1699423_1699328, который полностью идентичен первому, вообще не определено, какой белок кодирует данный ген ("hypothetical protein");
  • для участка CGSP14&chr&c_1457937_1458032, отличающегося от всех остальных А вместо G в позиции 22 блока, ген аннотирован как "bacterocin transport accessory protein";
  • для участка CGSP14&chr&c_445740_445835, идентичного первому, — "DNA polymerase IV";
  • остальные участки содержат слишком много неконсервативных позиций или же перекрывающиеся гены.
  В записях GenBank для этих штаммов участки никак отдельно не аннотированы, blast также не помог найти аннотацию гена. Возможно, этот участок является частью какого-то другого кодирующего участка. В любом случае, программа совершенно точно не смогла правильно определить ген.

Ссылки:

[1] I. V. Kublanov, S. Kh. Bidjieva, A. V. Mardanov and E. A. Bonch-Osmolovskaya (2009). Desulfurococcus kamchatkensis sp. nov., a novel hyperthermophilic protein-degrading archaeon isolated from a Kamchatka hot spring. Int J Syst Evol Microbiol. 59:1743-7.
[2] Desulfurococcus // MicrobeWiki. [URL]
[3] Streptococcus pneumoniae // The kingdom of life. [URL]
[4] Пневмококк // Wikipedia: the free encyclopedia. [URL]
[5] How to read a phylogenetic tree // epidemic: Molecular Epidemiology and Evolution of Viral Pathogens. [URL]
[6] Инсерционная последовательность // Wikipedia: the free encyclopedia. [URL]
[7] ABC-Белки (ABC-транспортеры, суперсемейство транспортных белков ABC) // medbiol.ru. [URL]
[8] Защитная функция белков // Wikipedia: the free encyclopedia. [URL]