практикумы №3-5

PDB, PyMOL

Пиохелинсинтаза PchD Синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa)


Структура в целом

Тип макромолекулы - белок, в структуре одна полимерная цепь, разделённая на два домена. В одну биологическую единицу входит одна полимерная цепь, с ассиметрической единицей различий нет.

PchD состоит из большой N-концевой субъеденицы (Аcore) и меньшей C-концевоой субъеденицы (Asub) [1].

Рис. 1
Рис. 1. Общая структура белка (лиганд не показан)

Полимерная цепь

Белок относится к бактерии Pseudomonas aeruginosa. Мутаций в последовательности относительно референса нет, отсутствуют модифицированные аминокислотные остатки.
PDB: 7TZ4 Uniprot: PCHD_PSEAE общее наименование: PchD

Рис. 2
Рис. 2. Вторичная структура белка (изменена проекция относительно рис.1 для наглядности). По протяженности отдельного участка преобладают альфа-спирали, количественно альфа-спиралей и бета-листов примерно одинаково. Также в аннотации вторичной структуры на Uniprot на участке 476-478 амк указана структура turn между двумя бета-листами (самыми протяженными, в меньшем домене), что вероятно является проблемой данной аннотации.

Малые молекулы

Запись PDB содержит малую молекулу 4-цианосалицил-АМС, являющуюся объектом исследования в оргинальной статье. PchD участвует в биосинтезе пиохелина, необходимого для стимуляции роста бактерий. Данная малая молекула является одной из модификаций ингибитора (салицил-АМС) домена аденилирования, которые могут стать терапевтическими препаратами против инфекций синегнойной палочки. Введение нитрильной группы позволило расширить электрофильное салициловое кольцо, которое в теории могло было бы ковалентно связываться с цистеином в активном центре (рис.4, однако исследование показало, что этого не происходит). Белок и ингибитор были синтезированы независимо, а затем со-кристаллизованы.

краткое наименование: KUX, полное: 5'-O-[(4-cyano-2-hydroxybenzoyl)sulfamoyl]adenosine
соответствующие строки в оригинальном файле KUX.pdb

Рис. 3
Рис. 3. Аминокислотные остатки белка на расстоянии до 5А от молекулы лиганда KUX.

Рис. 4
Рис. 4. Цистеин в позиции 250, с которым по предположению в оригинальной статье должен был ковалентно связываться лиганд.

Рис. 5
Рис. 5. PchD, связанный с 4-цианосалицил-АМС (общий вид). Показаны водородоные связи на расстоянии 5А. Видно, что лиганд свзывается с большой субъеденицей (в кармане связывания).

Взаимодействия

Водородные связи, затрагивающие атомы остова

Рис. 6
Рис. 6. Водородные связи, поддерживающие бета-листы.

Рис. 7
Рис. 7. Водородные связи, поддерживающие альфа-спирали.

Водородные связи, затрагивающие атомы боковых радикалов аминокислот

Рис. 8
Рис. 8. Водородные связи имидазола His-90, образованные с гидроксильным водородом Tyr-135 и карбонильными кислородами остова.

Солевой мостик

Рис. 9
Рис. 9. Солевой мостик между боковыми радикалами Arg-394 и Glu-372.

Дисульфидная связь
Белок содержит много остатков цистеина, однако ни один из них не связан в дисульфидный мостик. Поскольку цистеиновые остатки распределены по всему белку, для наглядности удобно скрыть всю остальную структуру (рис. 10, пространственное расположение совпадает с таковым на рис.1). Также примечателен Cys-101, который имеет странное строение, ведь в аннотации нет информации о модифицированных остатках (рис. 11). Анализ оригинальной статьи и источников не дал ответа, поэтому предположу, что это ошибка аннотации (смущает валентность бета-углерода, как минимум).

Рис. 10
Рис. 10. Все остатки цистеина в белке PchD.

Рис. 11
Рис. 11. Cys-101.

Стекинг

Рис. 12
Рис. 12. T-стекинг индольных систем триптофанов.

Рис. 13
Рис. 13. Параллельно сдвинутый пи-пи стекинг тирозина и фенилаланина.

Ферментативная активность

Для PchD в аннотации PDB указан EC: 2.7.7, то есть без последнего подкласса фермента. В аннотации UniProt указан EC:6.2.1.61, возникает противоречие. По первой аннтоции белок является нуклеотидтрансферазой, а по второй - кислотно-тиольной лигазой. Для рассмотрения в практикуме я использую EC:6.2.1.61, поскольку (1) данная классификация дает больше информации и (2) на мой взгляд лучше соответствует описанию ферментативной активности белка в оригинальной статье.

Белок PchD участвует в биосинтезе сидерофора пиохелина, в частности аденилирует салицилат (первая реакция синтеза пиохелина, рис. 14) и присоединяет его к голоформе белка PchE посредством тиоэфирной связи с фосфопантетеиновой частью. То есть данный фермент активирует салицилат и переносит соединение на белок-переносчик арила.

Рис. 14
Рис. 14. Реакция активации салицилата, катализируемая PchD [1].

Каталитически важными являются остатки His-244 и Lys-529, которые придерживают кислороды в лиганде* (рис.15). Аминокислоты активного центра не взаимодействуют между собой, на расстоянии 5А от них же взаимодействие наблюдается только между His-244 и Phe-246 (рис.16). Расстояние, на котором молекула ингибитора расположена относительно активного может быть определено как длина водородных связей между атомами ингибитора и каталитически важных аминокислот, то есть около 2-2,5 ангстрем.

Рис. 15
Рис. 15. Аминокислотные остатки кармана связывания (на расстоянии 5А от лиганда), синим отмечены аминокислоты активного центра: His-244, придерживающий О32 лиганда, и Lys-529, придерживающий О13, О31 и О34 лиганда.

Рис. 16
Рис. 16. Аминокислотные остатки кармана связывания (на расстоянии 5А от каталитически активных аминокислот), синим отмечены аминокислоты активного центра: His-244, взаимодейcтвующий с Phe-246, и Lys-529.

*Является некоторым упрощением, поскольку в аннотации не приведены active site.

Источники:

  1. Оригинальная статья (Shelton C. L. et al. Rational inhibitor design for Pseudomonas aeruginosa salicylate adenylation enzyme PchD //JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. – 2022. – Т. 27. – №. 6. – С. 541-551)