практикум №7

DeepTMHMM, OPM

Трансмембранные белки.


Трансмембранные белки (ТМБ) представляют собой особый класс мембранных белков, которые пронизывают клеточные мембраны и играют важную роль во многих биологических процессах. Предсказание их трёхмерной структуры остается сложной задачей структурной биоинформатики из-за уникальных физико-химических свойств и трудностей в экспериментальном определении структур. Современным инструментом для предсказания топологии и классификации ТМБ по последовательности является DeepTMHMM, основанный на глубоком обучении [1]. Для рассчета положения белка относительно мембраны (глубины погружения, угла наклона) используется БД Orientations of Proteins in Membranes (OPM), принимающая пространственные структуры белков из PDB и использующая физико-химические расчеты [2].

Целью практикума является сравнение предсказаний трансмембранных участков, сделанных вышеупомянутыми программами, в представителях двух основных структурных классов ТМБ: альфа-спирального и бета-листового белков.

Вместо «бета-листовых» в данном контексте правильнее говорить о «бета-цилиндрических» или «бета-бочонковых» белках (beta-barrel transmembrane protein).

Сравнение предсказаний в бета-листовом белке

Для анализа белка, в трансмембранной части которого находятся β-листы, в БД OPM был выбран гемолитический лектин CEL-III (hemolytic lectin CEL-III), выделенный из морского огурца и представляющий собой гомогептамер. Интерес к данной макромолекуле вызван тем, что это единственный белок в семействе эукариотических порообразующих токсинов в суперсемействе порообразующих бета-листковых токсинов (табл. 1) со структурой, вызывающей целый ряд ассоциаций (рис. 1).

Таблица 1. Характеристики гемолитического лектина CEL-III. Классификация взята из БД OPM.
PDB ID 3W9T
UniProt ID CEL3_PSEEC
Тип Трансмембранные белки
Класс Бета-бочковые трансмембранные белки
Суперсемейство Токсины, образующие бета-листы
Семейство Эукариотические порообразующие токсины
Вид Pseudocnus echinatus/Cucumaria echinata (Sea cucumber)
Локализация Секретируемый токсин

Данный лектин состоит из двух углеводсвязывающих доменов (1, 2) и одного домена олигомеризаци (3). После связывания с углеводными цепями на поверхности клетки через домены 1 и 2 домен 3 самоассоциируется, образуя трансмембранные поры, что приводит к лизису или гибели клетки, подобно другим порообразующим токсинам различных организмов [3].

Рис. 1. Пространственная структура гемолитического лектина CEL-III.
Сверху белок в мембранном окружении (ОРМ): красный пунктир - внешний липидный слой мембраны., синий пунктир - внутренний липид. сл. м. Снизу - вид в пору (PDB).

Координаты трансмембранных участков белка в OPM: 1(318- 330), 2(340- 353).

Предсказанные DeepTMHMM координаты трансмембранных участков: -

Последовательность цепи белка для запуска программы взята с PDB. Результат продемонстрирован на рис. 2 и в текстовом виде.

Рис. 2. Предсказанная DeepTMHMM топология гемолитического лектина CEL-III и ее достоверность. По горизонтальной оси отложена последовательность, по вертикальной - вероятность правильного предсказания топологии. Предсказано, что белок глобулярный и не пересекает мембрану, а также не имеет сигнальной последовательности.

Трансмембранных участков предсказано не было. Я предполагаю, что это связано с биологией белка (см. выше). Подобные белки секретируются в растворимых формах, то есть имеют определенное количество заряженных аминокислот. Поскольку модель работает с вероятностями, то чем больше будет заряженных аминокислот, тем с большей вероятностью весь белок предскажется глобулярным. Действительно, в статье [3] преполагается, что гидрофобные участки белка станновятся доступными только после связывания токсина с мишенью, что, в свою очередь, приводит к гептамеризации и формированию поры. То есть кодирующая первичную аминокислотную последовательность и декодирующая топологию с помощью модели пространства состояний программа не может предсказать(/знать/учесть) конформационные перестройки белка в третичной форме.

Сравнение предсказаний в альфа-спиральном белке

Для анализа белка, в трансмембранной части которого находятся α-спирали, мне был выдан симпортер двухвалентных анионов/Na+ холерного вибриона и его гуманизированного варианта (divalent anion/Na+ symporter from Vibrio cholerae and a humanized variant). Название белка копирует название статьи [4], в которой была получена его структура, а точнее комплекс с ионами Na+ и субстратом (сукцинатом). Мембранные переносчики, принадлежащие к семейству симпортеров двухвалентных анионов/Na+ (DASS), перемещают промежуточные продукты цикла Кребса или сульфат через клеточную мембрану, как правило, используя уже существующий градиент Na+. Белок из семейства DASS холерного вибриона, то есть объект интереса, называется VcINDY - Na+-зависимый дикарбоксилатный транспортер из Vibrio cholerae. В БД UniProt он называется транспортер сеймейства NadC (Transporter, NadC family).

Таблица 2. Характеристики VcINDY. Классификация взята из БД OPM.
PDB ID 5uld
UniProt ID Q9KNE0_VIBCH
Тип Трансмембранные белки
Класс Альфа-спиральный политоп
Суперсемейство Переносчик ионов
Семейство Двухвалентный анион: семейство Na+-переносчиков (DASS)
Вид Vibrio cholerae
Локализация Внутренняя мембрана грамотрицательных бактерий

Данный транспортер представляет собой гомодимер, субъединицы состоят из двух идентичных цепей.

Рис. 3. Пространственная структура транспортера VcINDY. Белок в мембранном окружении (ОРМ): красный пунктир - внешний липидный слой мембраны, синий пунктир - внутренний липид. сл. м.

Последовательность цепи белка для запуска программы взята с PDB. Результат продемонстрирован на рис. 4 и в текстовом виде. В табл. 3 приведено сравнение предсказаний.

Рис. 4. Предсказанная DeepTMHMM топология транспортера VcINDY и ее достоверность (п-ть с PDB). По горизонтальной оси отложена последовательность, по вертикальной - вероятность правильного предсказания топологии. Программа предсказала 15 трансмембранных участков (показаны красным), а именно ТМ спиралей.

Таблица 3. Сравнение предсказаний ТМ участков транспортера VcINDY (п-ть с PDB).
№ Предсказание DeepTMHMM Расчет OPM
1 6-22 20-38
2 31-42 47-61
3 49-63 66-80
4 81-90 95-110
5 119-132 /
6 135-144 /
7 168-178 185-195
8 205-222 214-236
9 245-260 262-277
10 277-287 292-306
11 305-319 320-336
12 342-355 358-375
13 358-369 378-391
14 384-401 401-413
15 425-444 440-461

Чтобы было удобнее анализировать данные табл. 3, построим по ней график, на котором предсказанные и рассчитанные трансмембранные участки отложим в виде отрезков (рис. 5).

Рис. 5. График сравнения предсказаний ТМ участков транспортера VcINDY (по п-ти с PDB). Отрезками обозначены ТМ участки, предсказанные DeepTMHMM (красные) и рассчитанные OPM (зеленые).

В целом, по графику видно, что предсказания похожи. Однако, в предсказании от DeepTMHMM на два ТМ участка больше (119-132, 135-144). ТМ участки практически не перекрываются, можно сказать, сдвинуты. Также сопоставимые участки различаются по длине.

В процессе выполнения практикума помимо упоминавшихся баз данных я также изучала PDBsum и обратила внимание, что для транспортера VcINDY указанные длины последовательности (в амк.) и структуры (также в амк.) не совпадают (рис. 6). Причем разница между этими длинами подозрительно похожа разницу тех позиций, на которые различаются предсказания выше. Оказывается, OPM для выполнения расчетов использует п-ть с UniProt, в то время как для предсказания в DeepTMHMM я подавала п-ть с PDB. Они, действительно, не совпадают по длине: с UniProt'а длинне. Таким образом, сравнение предсказаний, выполненное выше, вероятно, некорректно, поскольку использует хоть и немного, но различающиеся входные данные.

Рис. 6. Графическое summary о последовательности транспортера VcINDY (по UniProt ID: Q9KNE0_VIBCH). Длина последовательности и структуры в аминокислотах не совпадают.

На рис. 7 и в текстовом файле приведены результаты запуска DeepTMHMM с поданной п-тью с UniProt'а. В табл. 4 приведено сравнение, а на рис. 8 - график предсказаний ТМ участков.

Рис. 7. Предсказанная DeepTMHMM топология транспортера VcINDY и ее достоверность (п-ть с UniProt). По горизонтальной оси отложена последовательность, по вертикальной - вероятность правильного предсказания топологии. Программа предсказала 15 трансмембранных участков (показаны красным), а именно ТМ спиралей.

Таблица 4. Сравнение предсказаний ТМ участков транспортера VcINDY (п-ть с UniProt).
№ Предсказание DeepTMHMM Расчет OPM
1 22-39 20-38
2 47-60 47-61
3 66-80 66-80
4 96-106 95-110
5 133-145 /
6 147-158 /
7 182-191 185-195
8 222-239 214-236
9 262-277 262-277
10 294-305 292-306
11 326-336 320-336
12 359-376 358-375
13 379-389 378-391
14 401-417 401-413
15 441-461 440-461

Рис. 7. График сравнения предсказаний ТМ участков транспортера VcINDY. Отрезками обозначены ТМ участки, предсказанные DeepTMHMM (красные) и рассчитанные OPM (зеленые)..

Теперь предсказания совпали более полно, есть перекрывания, границы отличаются незначительно. При этом в предсказании DeepTMHMM сохранилось два дополнительных участка (133-145, 147-158). Это может быть связано с тем, что структура белка получена в комплексе с лигандом, из-за чего происходит изменение конформации и пропадают два ТМ участка, либо иметь другую причину.

  1. Hallgren J. et al. DeepTMHMM predicts alpha and beta transmembrane proteins using deep neural networks //biorxiv. – 2022. – С. 2022.04. 08.487609.
  2. Lomize M. A. et al. OPM: orientations of proteins in membranes database //Bioinformatics. – 2006. – Т. 22. – №. 5. – С. 623-625.
  3. Unno, Hideaki et al. “Hemolytic lectin CEL-III heptamerizes via a large structural transition from α-helices to a β-barrel during the transmembrane pore formation process.” The Journal of biological chemistry vol. 289,18 (2014): 12805-12. doi:10.1074/jbc.M113.541896
  4. Nie, R., Stark, S., Symersky, J. et al. Structure and function of the divalent anion/Na+ symporter from Vibrio cholerae and a humanized variant. Nat Commun 8, 15009 (2017). https://doi.org/10.1038/ncomms15009