Парное выравнивание белковых последовательностей и применение алгоритмов парных выравниваний к цитратсинтазе I

Модель эволюции белковых последовательностей

Задача и методы: В данном задании вручную произведено парное выравнивание последовательности моего белка с несколькими 20-ти аминокислотными участками, которые были предварительно получены как результат работы скрипта evolve_protein.pl при использовании различных параметров. Скрипт иллюстрирует появление случайных мутаций в последовательности белка из-за ошибок в деятельности ДНК-полимеразы и использует для своей работы несколько параметров: (i) вероятность возникновения мутации в данном месте аминокислотной последовательности {параметр -i}; (ii) вероятность того, что при наличии мутации произойдёт замена, а не делеция или вставка другой аминокислоты {параметр -r}.

Для работы скрипта также определены следующие дополнительные параметры:

• -f: создаёт полноразмерные последовательности
• -t: задает количество создаваемых последовательностей
• -g: задает количество "поколений мутагенеза", то есть проходов по исходной последовательности

Результаты работы скрипта: В результате применения скрипта evolve_protein.pl были получены следующие 20-ти аминокислотные фрагменты искусственных мутантов цитратсинтазы I из B.subtilis (для каждого фрагмента в названии указаны значения параметров (i) и (ii)):

1. >0|simulation_result|change=0.6|replace=0.6|generations=1 SVLSVQFIALRFNLTYFPKT
2. >0|simulation_result|change=0.6|replace=0.8|generations=1 PTFAESLQDFMDRDAGRNCS
3. >0|simulation_result|change=0.4|replace=0.8|generations=1 MSDIGEEHNFEAYKEKLTGE

Результаты выравнивания: Иллюстрации выравниваний (получены с помощью программы JalView) и их рассчитанные параметры представлены в таблице (см. ниже). В использованном варианте раскраски аминокислоты подразделены на следующие группы по свойствам бокового радикала:

• c более или менее неполярным боковым радикалом (синий цвет)
• c положительно заряженным радикалом (светло-зелёный цвет)
• c отрицательно заряженным радикалом (красный цвет)
• c незаряженным полярным радикалом (жёлтый цвет)
• c ароматическим боковым радикалом (голубой цвет)

Для каждого выравнивания были подсчитаны следующие параметры: Identity - процент идентичных аминокислот в двух последовательностях от общей длины участка выравнивания, Similarity - процент схожих по свойствам аминокислот между двумя последовательностям, Alignment weight - вес выравнивания по матрице BLOSUM62, учитывался штраф за открытие пробела (gap) в -12, а за продолжение пробела -2. (о матрицах аминокислотных замен и весах выравниваний см. ниже). Все результаты подсчётов приведены в таблице.

Выравнивание	Identity	Similarity	Alignment weight
	10/21*100% = 47,6%	10/21*100% = 47,6%	14
	9/21*100% = 42,86%	13/21*100% = 61,9%	17
	13/22*100% = 59%	14/22*100% = 63,64%	44

Обсуждение результатов:

• Наблюдается незначительное различие между similarity и identity, что может быть обусловлено тем, что рассмотрено сравнительно большое количество групп аминокислот, что привело к уменьшению similarity. Вероятно, similarity является наименее объективным параметром сравнения выравнивания из трёх предложенных, так как зависит от выбора групп аминокислот, считающихся схожими в конкретном случае. Но стоит сказать, что использование similarity весьма удобно при сравнении функциональных свойств двух белков, что правда имеет к нашей модели эволюции белковых последовательностей косвенное отношение.
• Выравнивания 1 и 2 более или менее сходны по всем трём параметрам оценки, что обусловлено одинаковой вероятностью замены в 60%. Как и предполагалось, в выравнивании 3 из-за того, что вероятность внесения каких-либо изменений составляла всего 40%, больше половины аминокислот остались консенсусными для двух последовательностей. Это даёт последнему выравниванию наибольшие результаты по всем трём критериям оценки качества выравнивания.

Выравнивание цитратсинтазы I с её ортологами

В данном разделе приведены результаты, полученные при проведении выравнивания моего белка с его ортологами (об ортологах см. соответствующий раздел второго семестра). Сначала был составлен файл, содержащий последовательности трёх белков в FASTA-формате.
Затем с использованием программы MUSCLE было проведено выравнивание последовательностей. Для каждой пары выровненных последовательностей были определены характеристики с использованием программы infoalign из пакета EMBOSS.

Описание программы infoalign:
Программа выводит данные о множественном (в том числе и о парном) выравнивании последовательностей. Важнейшие опции:

• -gaps показывает количество пропусков
• -gapcount показывает число аминокислот, соотнесённых с пропуском
• -idcount показывает количество идентичных позиций
• -simcount показывает число похожих позиций
• -difcount показывает число различных позиций

Ниже представлены выходные данные программы infoalign для трёх пар последовательностей из совместного выравнивания.

Name	Sequence Length	Aligned Length	Gaps	Gap Length	Identity	Similarity	Difference	% Change	Weight
CISY_BACSU/1-366	366	377	3	11	366	0	0	2.917772	1.000000
CISY_BACCO/1-373	373	377	1	4	142	73	158	62.334217	1.000000

Name	Sequence Length	Aligned Length	Gaps	Gap Length	Identity	Similarity	Difference	% Change	Weight
CISY_BACSU/1-366	366	377	3	11	366	0	0	2.917772	1.000000
Q81QS0_BACAN/1-372	372	378	2	6	146	72	154	61.375660	1.000000

Name	Sequence Length	Aligned Length	Gaps	Gap Length	Identity	Similarity	Difference	% Change	Weight
CISY_BACCO/1-373	373	377	1	4	373	0	0	1.061008	1.000000
Q81QS0_BACAN/1-372	372	378	2	6	271	35	66	28.306879	1.000000

Выравнивание трёх последовательностей было окрашено по схеме Clustalx с использованием порога идентичности в 66% (позволяет окрашивать только те позиции, где идентичными являются 2 или 3 аминокислоты во множественном выравнивании (см. рис. 1).

Рис. 1 Участок выравнивания с 1-ой по 122-ю позицию выравнивания, раскрашенный по схеме Clustalx с порогом идентичности в 66%.