Множественное выравнивание

Создание репрезентативной выборки гомологов белка CISY_BACSU

Часть 1: Из Procaryota

Задача этого раздела - создать выборку гомологов белка, представляющих различные группы из Procaryota. В поиске BLAST были исключены все эукариоты, а также представители филума Firmicutes, к которому относится B. subtilis.

Так как BLAST не может чисто технически вывести все найденные гомологи до E-value, которое уже можно расценивать как подвергающее сомнению гомологию белков, поисковый запрос был разбит на несколько меньших запросов по крупным группам внутри Procaryota. Были сделаны отдельные запросы по каждому филуму, что, не уменьшая разнообразия результатов, позволяет облегчить работу сервера с большими объёмами данных. Данные о параметрах запросов и их результатах представлены ниже (Табл.1, Рис. 1). Все запросы проводились с пороговым E-value в 0.001, гомологи выбирались из разных родов и субгрупп в филумах Procaryota. Количество выбранных из данной группы гомологов соответствует общему количеству найденного для этой группы исходного материала.
ИТОГ: Составлена выборка из 26 последовательностей гомологов (включая исходный белок) из Procaryota.

Рис. 1 Распределение гомологов по группам бактерий (репрезентативность выборки)

Таблица 1. Параметры и результаты поиска для создания выборки гомологов

Группа из Procaryota	Количество находок	Взято в выборку	Идентификаторы
a-proteobacteria	576	2	YP_006369433.1, ZP_09088103.1
b-proteobacteria	572	2	ZP_07992978.1, ZP_21936797.1
g-proteobacteria	1220	5	ZP_11335136.1, ZP_09996965.1, ZP_05118406.1 YP_001668175.1, ZP_06063623.1
d-proteobacteria	96	1	YP_004194949.1
Actinobacteria	814	3	YP_645286.1, ZP_08883122.1, ZP_05006273.1
Cyanobacteria	114	2	YP_001803316.1, NP_484266.1
Bacteroidetes/Chlorobi group	199	2	YP_677887.1, ZP_03701017.1
Archeae	201	3	YP_006542193.1, ZP_10769452.1, NP_070169.1
Все остальные	472	5	YP_003322919.1, YP_005654985.1, ZP_10244813.1, YP_004171611.1, ZP_01857072.1
Итого:	4264	25

Последовательности выбранных белков доступны по ссылке: FASTA-файл

Часть 2: Гомологи белка CISY_BACSU среди эукариот

В данном разделе был проведён поиск BLAST по Eucaryota (параметры: E-value threshold = 0.001, база RefSeq). Данные по распределению гомологов среди групп Eucaryota представлены на рисунке 2. Всего обнаружено 889 белков, удовлетворяющих условиям поиска. Среди них выбраны по нескольку из разных групп, для каждого проведена проверка на предмет того, принадлежит ли белок геному митохондрии/хлоропласта или же закодирован в ядре.
Филогенетическое дерево распределения гомологов белка среди эукариот доступно по ссылке: Рисунок 2
Всего для выборки взято двенадцать белков из эукариот, их последовательности доступны по ссылке: FASTA-файл .
Анализ расположения генов показал, что 10 из 12 генов являются ядерными, а два оставшихся (из Aspergillus niger и Toxoplasma gondii) - митохондриальными.

Таблица 2. Итоговый набор гомологов белка из разных доменов, вошедших в выборку. Во второй колонке в скобках указано название подцарства/субфилума. Золотым цветом выделены митохондриально закодированные белки. Оранжевым выделен исходный белок CISY_BACSU.

Домен	Филум/Царство	Организм	Белки
Eukaryota	Alveolata (Ciliophora)	Tetrahymena pyriformis	BAF79583.1
	Alveolata (Apicomplexa)	Babesia bovis	XP_001610210.1
	Alveolata (Apicomplexa)	Toxoplasma gondii (mitoch.)	ABP37863.1
	Amoebozoa (Mycetozoa)	Dictyostelium discoideum	XP_647596.1
	Opisthokonta (Metazoa)	Schistosoma japonicum	CAX73475.1
	Opisthokonta (Metazoa)	Bos taurus	ABD77273.1
	Opisthokonta (Metazoa)	Homo sapiens	AAC25560.1
	Opisthokonta (Fungi)	Aspergillus niger	XP_001389414.2
	Opisthokonta (Fungi)	Aspergillus niger (mitoch.)	P51044.1
	Viridiplantae (Streptophyta)	Oryza sativa	AAG28777.1
	Viridiplantae (Streptophyta)	Arabidopsis thaliana	AAM62868.1
	Viridiplantae (Chlorophyta)	Chlamydomonas reinhardtii	XP_001695571.1
Eubacteria	Actinobacteria	Rubrobacter xylanophilus	YP_645286.1
	Actinobacteria	Saccharopolyspora spinosa	ZP_08883122.1
	Actinobacteria	Streptomyces clavuligerus	ZP_05006273.1
	Cyanobacteria (Chroococcales)	Cyanothece sp.	YP_001803316.1
	Cyanobacteria (Nostocales)	Nostoc sp.	NP_484266.1
	Proteobacteria (a)	Tistrella mobilis	YP_006369433.1
	Proteobacteria (a)	Mesorhizobium amorphae	ZP_09088103.1
	Proteobacteria (b)	Neisseria mucosa	ZP_07992978.1
	Proteobacteria (b)	Bordetella holmesii	ZP_21936797.1
	Proteobacteria (g)	Pseudomonas putida	YP_001668175.1
	Proteobacteria (g)	Acinetobacter johnsonii	ZP_06063623.1
	Proteobacteria (g)	Glaciecola pallidula	ZP_11335136.1
	Proteobacteria (g)	Acidithiobacillus thiooxidans	ZP_09996965.1
	Proteobacteria (g)	Vibrio parahaemolyticus	ZP_05118406.1
	Proteobacteria (d)	Desulfobulbus propionicus	YP_004194949.1
	Firmicutes	Bacillus subtilis	P39119
	Bacteroidetes/Chlorobi group	Cytophaga hutchinsonii	YP_677887.1
	Bacteroidetes/Chlorobi group	Flavobacteria bacterium	ZP_03701017.1
	Thermobaculum	Thermobaculum terrenum	YP_003322919.1
	Deinococcus-Thermus	Thermus sp.	YP_005654985.1
	Chloroflexi	Nitrolancetus hollandicus	ZP_10244813.1
	Deinococcus-Thermus	Deinococcus maricopensis	YP_004171611.1
	Planctomycetes	Planctomycetes maris	ZP_01857072.1
Archaea	Euryarchaeota (Halobacteria)	Natrinema spPlanctomyces.	YP_006542193.1
	Euryarchaeota (Halobacteria)	Halogranum salarium	ZP_10769452.1
	Euryarchaeota (Archaeglobales)	Archaeoglobus fulgidus	NP_070169.1

Множественное выравнивание гомологов белка CISY_BACSU

C помощью программы MUSCLE были построены три множественных выравнивания: изучаемый белок и прокариотические гомологи, изучаемый белок и эукариотические гомологи, вся выборка целиком (см. рис. 3,4,5 соответственно). На рисунках серым выделен CISY_BACSU, {!} чтобы просмотреть увеличенную версию изображения, кликните по интересующему рисунку правой кнопкой мыши, затем увеличьте. Раскраска выравниваний осуществлена по стандартной цветовой схеме Clustalx.

Рис. 3 Множественное выравнивание последовательности CISY_BACSU и его гомологов из прокариот

Рис. 4 Множественное выравнивание последовательности CISY_BACSU и его гомологов из эукариот

Рис. 5 Множественное выравнивание последовательности CISY_BACSU со всеми последовательностями гомологов из полученной выборки

Затем был проведён анализ выравнивания в программе Jalview. С последовательностью CISY_BACSU был проассоциирован PDB-файл со вторичной структурой белка, что позволило выделить остатки, которые ранее были определены как функционально важные уже на выравнивании.
К исходному выравниванию были добавлены три новых строки аннотации:

SECONDARY: отражает информацию об участках вторичной структуры, таких как бета-тяжи и альфа-спирали.
LIGANDS: Показывает, какие участки участвуют в связывании лигандов - кофермента А и молекулы цитрата. Такие участки помечены буквой "L".
BLOCKS: в этой строке аннотации отмечены остатки (в строке BLOCKS стоит буква "B"), формирующие блоки - более или менее консервативные участки, хорошо выравниваемые между гомологами.

Рис. 6 Аннотированное выравнивание всех гомологов из выборки (комментарии см. в тексте)

Результаты анализа множественного выравнивания гомологов белка CISY_BACSU

General: Характеризуя выравнивание в целом, можно отметить, что консервативных, хорошо выравненных участков сравнительно много, причём хорошо выравниваются гомологи между всеми тремя доменами живых организмов, а не только среди прокариот или эукариот. Почти все белки имеют сходную длину, что за редким исключением позволяет избежать невыравненных "хвостов".

Secondary: Все участки с определённой вторичной структурой входят в состав блоков, хотя консервативность в этих участках может быть в целом и не очень большой. Надо отметить, что блоки затрагивают участки, превосходящие по размерам спирали и тяжи, т. е. хорошо выравниваются даже фрагменты с неупорядоченной вторичной структурой. Выделение блоков я проводил, ориентируясь на строки аннотации conservation и quality, а также на группы последовательно идущих более или менее строго консервативных остатков, которые формируют "скелет" такого блока.
Среди элементов вторичной структуры обнаружены две альфа-спирали, которые прерываются колонками гэпов. Причём интересно, что такая ситуация связана с тем, что у эукариотических гомологов в этом месте есть дополнительный участок, который и даёт колонку гэпов.

Ligands: На рисунке 7 показан белок, на котором чёрным отмечены остатки, участвующие в формировании связей с лигандами. Все белки-гомологи катализируют одну реакцию, поэтому резонно предположить, что такие остатки будут консервативны среди гомологов, так как цитрат - продукт реакции, а кофермент А - субстрат. Так ли это в реальности? В таблице 3 приведена информация по тому, насколько консервативен тот или иной остаток. Консервативность (в процентах) показывает, в каком проценте последовательностей гомологов выравнен такой же остаток, как и в CISY_BACSU.

Таблица 3. Консервативность остатков, участвующих в связывании лиганда

Остаток	Asp 181	His 213	Arg 246	Arg 253	Lys 297	Arg 300	Asn 305
Консервативность (%)	97	100	43(*)	57	23	40(**)	100

(*) кроме того, ещё в 34% последовательностей на месте этого аргинина находится лизин, близкий к первому по свойствам. Таким образом можно сказать, что суммарная доля положительно заряженных а/к в этом положении составляет 77%.
(**) ещё в 49% последовательностей - лизин, сумма по положительно заряженным - 89%.

Вывод: Таким образом, можно заключить, что подавляющее большинство остатков, взаимодействующих с лигандами, являются консервативными, что позволяет предположить одинаковый механизм реакции в различных организмах. Кроме того, стоит отметить, что, даже если замена происходит, то в большой доле случаев она производится на близкий по свойствам остаток (пример: Arg -> Lys).

Рис. 7 CISY_BACSU: чёрным показаны остатки, участвующие во взаимодействии с лигандами; лиганды показаны атомными радиусами (cpk); остатки в белке покрашены в соответствии с химической природой радикала (описание см. в практикуме 5).