Реконструкция деревьев по нуклеотидным последовательностям.
Деревья, содержащие паралоги.

Построение дерева по нуклеотидным последовательностям

В данном задании мы строим филогенетическое дерево бактерий, с которыми работали и в прошлых двух практикумах, но с использованием методов, использующих в качестве входных данных нуклеотидные последовательности. К таким методам относятся Neighbor-Joining, Minimum evolution, Maximum likelihood. В качестве последовательности используем 16S РНК бактерий.

В таблице 1 для каждой из рассматриваемых бактерий приведены: AC записи EMBL, в которой обнаружена последовательность 16S rRNA, координаты этой РНК в этой записи, а также то, на прямой или обратной цепи она расположена.

Таблица 1. Информация о полученных записях, содержащих последовательность 16S РНК

Бактерия	Мнемоника	AC записи EMBL	Координаты	Цепь
Bacillus anthracis	BACAN	CP002183	9750..11308	Прямая
Clostridium botulinum	CLOB1	CP000726.1	48468..49969	Прямая
Enterococcus faecalis	ENTFA	AE016830	248466..249987	Прямая
Geobacillus kaustophilus	GEOKA	BA000043.1	10421..11973	Прямая
Lactobacillus delbrueckii	LACDA	CP002341.1	33581..35141	Прямая
Listeria monocytogenes	LISMO	CP007492.1	242732..244284	Прямая
Streptococcus pneumoniae	STRPN	CP006844.1	1696703..1698247	Обратная

Все полученные последовательности 16S РНК были помещены в файл: FASTA и переименованы в соответствии с мнемоникой конкретного вида. Затем последовательности были выравнены программой Muscle (использовался web-интерфейс). Выравнивание было импортировано в программу MEGA, в которой было построено филогенетическое дерево методом Neighbour joining. На рисунке 1 представлено сравнение правильного дерева и построенного по последовательности 16S РНК.

Рисунок 1. Правильное дерево (слева) и дерево, построенное методом Neighbour joining по последовательностям 16S РНК (справа).

Реконструированное дерево с правильным не совпадает. Из четырёх ветвей, присутствующих в правильном дереве, две присутствуют и в реконструированном по нуклеотидным последовательностям. Отсутствуют следующие ветви: {BACAN,LISMO,GEOKA}&{others} и {LACDA,ENTFA,STRPN}&{others}.

Вообще-то, исходя из того, что в нуклеотидных последовательностях всего четыре различных элемента алфавита (против 20 в белковых последовательностях), можно предположить, что основанные на них филогенетические деревья будут хуже реконструировать реальность. Это связано с большей вероятностью неправильного выравнивания, а также с тем, что в таких выравниваниях будут учитываться случайные молчащие мутации, которые никак не влияют на последовательность белка.

Построение и анализ дерева, содержащего паралоги

Сначала приведу определения:

Паралоги - последовательности, к разделению которых привело удвоение гена внутри одного организма (в результате хромосомной мутации). В качестве примера паралогов приводятся, например, гены различных форм гемоглобина человека (α, β, γ и др.).

Ортологи - последовательности, к разделению которых привел акт видообразования. Примером ортологичных генов могут быть гены гемоглобина β у человека и лемура.

В данном разделе мы найдем гомологи белка CLPX_BACSU (ATP-dependent Clp protease) в рассматриваемых бактериях. На дереве, построенном по таким гомологам, попробуем указать на два типа эволюционных событий: 1) дупликацию гена; 2) разделение путей эволюции белков в результате видообразования.

С помощью команды blastp (порог E-value 0,001) среди всех белков всех бактерий, упомянутых в первом практикуме, были найдены гомологи, а затем отобраны те, которые относятся к рассматриваемому списку из семи бактерий. полная выдача blastp: Out_blast. Далее были отобраны те, которые относятся к нашим семи бактериям: Out_select. Для 31 белка были получены последовательности в fasta-формате: Protein_seq.

Все полученные последовательности были выравнены с помощью программы Muscle, затем построено дерево гомологов методом Neighbour joining.

Рисунок 2. Дерево, построенное по последовательностям гомологов белка CLPX_BACSU из семи рассматриваемых бактерий. Квадратной скобкой выделен пример ветви дерева, состоящей из белков-ортологов.

Пример ортологов: CLPX_LISMO, CLPX_BACAN, CLPX_LACDA, CLPX_CLOB1, CLPX_GEOKA, CLPX_ENTFA и CLPX_STRPN (показаны на рисунке 2 скобкой).
Пример паралогов: B1SHF4_BACAN и B0AWL5_BACAN (образовались в результате дупликации гена).

В качестве примера разделения белков в результате видообразования: разделение на ветвь, содержащую CLPX_X, и ветвь с белками HSLU_X (точка дивергенции обозначена на рисунке красным квадратиком).